Multiplexed Sandwich ELISA

Report
Forum Biotech, Analytica 2010
Dr. Hanswilly Müller
Sensovation
24. März 2010
1
Gliederung
Einführung, Begriffserklärung, Motivation
Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich
• Colorimetrische
Fluoreszenz Detektion
• Multiplex Modell – Assay
Colorimetrischer Assay zum Nachweis von
Grippeviren
• Assay-Entwicklung und Validierung
an Patientenproben
24. März 2010
2
Gliederung
Einführung, Begriffserklärung, Motivation
Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich
• Colorimetrische
Fluoreszenz Detektion
• Multiplex Modell – Assay
Colorimetrischer Assay zum Nachweis von
Grippeviren
• Assay Entwicklung und Validierung
an Patientenproben
24. März 2010
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Multiplexing
Trend zur personalisierten Medizin
erfordert bessere, mehr und häufigere
diagnostische Untersuchungen
Simultane Messung verschiedener
Parameter in einer Probe
Proteine, DNA
Multiplexed
Diagnostics
Etablierte Multiplexing Techniken:
Planare Microarrays hoher Dichte: DNA arrays
Bead-basierter Ansatz mit Durchflusszytometrie (bis zu100-plex)
Unser Ansatz: Planare Microarrays in 96 Well Platten
Arrays geringer Dichte (z.B. 9 bis ca. 144 Spots pro Microarray)
Ideal für den Nachweis von Protein-Markern, Genotypisierung
Colorimetrische- und Fluoreszenz Detektion
24. März 2010
CLAIR®: Colorimetric Array Imaging
Reader für Microarrays
CCD-basierter Imaging Reader
Geeigent für IVD
Eigenständiges Gerät
Mit eingebautem Rechner,
Kontroll-Software, TouchScreen und integrierter Spot
Auswertung
Für die quantitative Auswertung
von Microarrays
Spot Größen von 50 – 500 µm
Schnelle Bildaufnahme
Ca. 2 Minuten pro Mikroplatte
Flexible Probenformate
96-well Platte, Strip-well Platte,
Objektträger
24. März 2010
Gliederung
Einführung, Begriffserklärung, Motivation
Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich
• Colorimetrische
Fluoreszenz Detektion
• Multiplex Modell – Assay
Colorimetrischer Assay zum Nachweis von
Grippeviren
• Assay Entwicklung und Validierung
an Patientenproben
24. März 2010
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„Arrays in Well“ Plattform
mit fluorogenen oder colorimetrischen Substraten
Arrays in Well (AIW)
• Microarrays in 96-Well Platten
• Multi-Analyt basierte Bioassays im einfachen und
vertrauten Mikroplatten Format
(C) 2009 Sensovation AG
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Prinzip: Array in Well
24. März 2010
Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte
Fluoreszenz und Colorimetrie
Direkte Fluoreszenz
Markierter Antikörper
Antigen
Fänger Antikörper
Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“
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Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte
Fluoreszenz und Colorimetrie
Verstärkte (Amplified)
Fluoreszenz (Tyramide)
HRP
CY3
CY3
HRP
CY3
CY3
H2 0 2
Markierter Antikörper
CY3
Antigen
Fänger Antikörper
CY3CY3CY3CY3CY3
Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“
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Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte
Fluoreszenz und Colorimetrie
Colorimetrie
HRP
HRP
TMB
TMB
TMB
TMB
H2 0 2
Markierter Antikörper
TMB
Antigen
TMB
TMB
Fänger Antikörper
TMB
TMB
TMB
TMB
Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“
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Technologie Vergleich anhand eines Modell Assays:
CLAIR vs. Confocal Scanning
Färbe Technik: Colorimetrie im Vergleich zu direkter
Fluoreszenz im Vergleich zu verstärkter Fluoreszenz
Reader Technologie: CLAIR Tecan LS400
=>CCD-Imager
Laser Scanner
Modell Assay
Adenovirus Hexon Protein (Virus Antigen)
Verdünnungsreihe von 156 ng/ml
bis 0.0009 ng/ml, plus Leerwert
Multiplexed Sandwich ELISA
Doppelbestimmung
Jedes Näpfchen enthielt eine
Anordnung von 3 x 3 Spots
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Array Layout
CLAIR
Konfokaler Scanner, Bilder
Colorimetrische Detektion
Direkte Fluoreszenz
24. März 2010
Verstärkte Fluoreszenz
CLAIR
Konfokaler Scanner, S / N
Vergleich Färbung / Reader
Verstärkte Fluoreszenz
(Cy3) ist die empfindlichste Methode,
Detektionsgrenze:
0.016 ng/ml
Direkte Fluoreszenz
(Dy633) ist etwa 2x
weniger empfindlich
TMB Assay Detektionsgrenze: 0.041 ng/ml.
Schlussfolgerung: Cy3/TECAN doppelt so empfindlich wie
Dy633/TECAN welche doppelt so empfindllich ist wie TMB/CLAIR.
24. März 2010
CLAIR
Konfokaler Scanner, Diskussion
Empfindlichkeit:
Colorimetrischer TMB-Assay ist nur ca. 2-mal bzw. 4-mal
weniger empfindlich als direkte / verstärkte Fluoreszenz
Dynamischer Bereich:
Colorimetrischer Assay hatte eine sehr gute Linearität über
2 Größenordnungen
Verstärkte Fluoreszenz hatte einen geringeren
dynamischen Bereich als die colorimetrische Messung
Direkte Fluoreszenz hatte eine gute Linearität über 3
Größenordnungen
Beachte: Dieser Vergleich beinhaltet Färbetechnik, kombiniert
mit Detektionstechnik: High End Forschungs - Scanner
(Fluoreszenz) gegenüber einem Routine-Reader (Colorimetrie)
24. März 2010
Gliederung
Einführung, Begriffserklärung, Motivation
Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich
• Colorimetrische
Fluoreszenz Detektion
• Multiplex Modell – Assay
Colorimetrischer Assay zum Nachweis von
Grippeviren
• Assay Entwicklung und Validierung
an Patientenproben
24. März 2010
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Multiplexed Virus Assay
Test von Grippeviren
Array Layout
Multiplexed Analyse
von 7 Grippeviren
Sandwich ELISA Assay
Colorimetrisches
Auslesen mit CLAIR
Reader
Verdünnungen von
Virus-Infiziertem ZellLysat
Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B
(InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)
24. März 2010
Multiplexed Virus Assay, Bilder
Beispiele
Schlussfolgerung:
Mit dem multiplex Assay konnten alle 46 analysierten VirusProben detektiert und korrekt klassifiziert werden.
Das Auslesen und die Auswertung mit CLAIR war schnell und
einfach. Die Analytik ist einfach automatisierbar.
24. März 2010
Analyse klinischer Proben
Analyse der genannten Grippeviren in 88 klinischen
Patientenproben mittels eines multiplex Assay
Die Patientenproben wurden parallel analysiert
Mittels colorimetrischer TMB-Detektion (CLAIR)
Mittels verstärkter Fluoreszenz (Laser Sanner, TECAN)
Die Pateintenproben waren zuvor mittels TR-FIA getestet
worden: 44 Proben waren Antigen-negativ, 44 waren
Antigen-positiv:
Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B
(InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)
24. März 2010
Analyse klinischer Proben
Array Layout
Jeder Fänger-Antikörper
wurde 6 mal gespottet:
Drei Spots mit hoher
Antikörper- Dichte
Drei Spots mit geringerer
Antikörper- Dichte
 Erhöhung des dynamischen
Bereichs, da einige Proben
mit hoher Antigen Konzentration Kreuzreaktion zeigten
Positive Kontrollen in allen
vier Ecken
Dienen auch als ReferenzSpots für das Grid bei der
automatischen Auswertung
24. März 2010
Analyse klinischer Proben, Bilder
Direkter Vergleich TMB/CLAIR und Cy3/TECAN
24. März 2010
Analyse klinischer Proben, Ergebnisse
Colorimetrische Detektion (CLAIR) lieferte vergleichbare Ergebnisse
zu dem Fluoreszenz-Test (verstärkte Fluoreszenz), gemessen mit dem Tecan
LS400
Tecan / Fluoreszenz charakterisierte 82 von 88 Proben richtig (gemessen
an der TR-FIA Referenzmethode)
CLAIR / Colorimetrie charakterisierte 77 von 88 Proben richtig (gemessen
an der TR-FIA Referenzmethode)
Alle falsch charakterisierte Proben waren PIV 3 Proben, die offenbar mit
der Zeit degradiert waren (TR-FIA Messungen fanden mehrere Wochen
früher statt)
Mit Fluoreszenz wurden die Proben gerade über dem “Cut-Off”
gemessen
Mit Colorimetrie wurden die Proben gerade unter dem “Cut-Off”
gemessen
 Die genaue Antigen-Konzentration zum Zeitpunkt dieses Experimentes ist unbekannt und könnte unter dem “Cut-Off” gelegen haben
24. März 2010
Zusammenfassung
Colorimetrische Detektion ist im Ergebnis vergleichbar
mit Fluoreszenz-Detektion (verstärkte Fluoreszenz)
Vergleichbare Empfindlichkeit und Linearität
Fluoreszenz Assays können einfach in colorimetrische
Assays “umgebaut” werden
Colorimetrische Assays und die dafür notwendigen
Geräte sind weniger komplex und preisgünstiger als die
entspechenden Fluoreszenz-Geräte
Colorimetrische Assays sind ideal für die Routineanalytik
in klinischen Labors, Veterinärmedizin und Lebensmittelanalytik
24. März 2010
Danke für Ihr Interesse!
24. März 2010

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