冷光儀應用於空氣菌落數測定

Report
輔英科技大學 職業安全衛生系
張淑瑩老師 專題生:呂柏賢、吳振豐
研究目的
實驗方法
菌落總數可以評估職場空氣微生物污染程度和衛生狀況。空氣微生物檢驗常
用的檢測方法有兩種:一種是自然沉降法,就是在一定的時間內從空氣中自然沉
降方式落入單位面積的微生物個數;另一種是衝擊式採樣法,可檢測空氣中每立
方公尺之總菌數(CFU/m3)。衝擊式採樣法能採集懸浮於空氣中的微生物顆粒,並
且不受環境氣流擾動之影響,採樣量準確,因此較能準確的測出空氣中細菌的含
量,已是我國公認的空氣採樣的首選方法,也是環檢所公告之室內空氣中細菌濃
度檢測方法。
ATP冷光儀(ATP luminometer)是用ATP來進行微生物總含量的檢測,其檢測
結果是以相對吸光值(relative light unit, RLU)呈現,所需檢測時間約十分
鐘,故它不像傳統細菌培養方法要經數天時間才得知結果,現已廣泛使用於職場
環境衛生與清潔品質管控。
本專題利用雙頭衝擊式採樣器及ATP冷光儀針對職場空氣細菌數之檢測作標準
化模式之研究。利用採樣器同時收集各採樣地點之空氣於兩個培養皿中,一個培
養皿經培養後以傳統平板計數算出落菌數,另一個培養皿則以ATP冷光儀測RLU值,
利用迴歸方程式求出兩者對數值間的線性關係。此標準線可針對各職場之空氣細
菌數進行快速估計,能讓業者即時了解廠區生物性危害的實際狀況,以利衛生安
全管控。
1.採樣前調配好胰蛋白大豆瓊脂培養基置於55mm無菌塑膠培養皿中,用石蠟膜封存並將其
放在冰桶內。
2.到達採樣地點後,將兩個含培養基之培養皿放置於雙頭可攜型衝擊式採樣器內,以衝擊
方式同時將細菌收集到兩個培養基上,設定好採樣器需要抽取的空氣體積和延遲時間,
就可按下開始鍵進行採樣(抽取空氣500L、延遲1分鐘、採雙頭)。採樣時需配戴口罩、
手套,手套要用75%酒精消毒,避免在採樣過程中污染樣品。(圖3)
3.每區之採樣均進行二重複。在進行下一次採樣前都要用酒精棉片擦拭過採樣器放置培養
皿的地方。採樣地點有:某HACCP食品工廠、學生餐廳廚房A、學生餐廳廚房B及某市場
雞肉攤。採樣原則:以採樣區域的中心點為採樣點,若有空調設備正下方則要避開。
4.採樣後,一採集頭內之培養皿置於 30 ± 1 ℃ 培養箱內培養 48 ± 2 小時,計算細菌
之菌落形成單位(Colony-forming unit,CFU)。 CFU計算方法 : X = Pr×1000/V, X為
CFU/m3 ,Pr為落菌數,V為採樣體積(L)(此計算公式參考雙頭可攜型衝擊式採樣器
DUO SAS 360說明書)。另一採集頭內之培養皿則以冷光筆塗抹後,置於ATP冷光儀中
測RLU 。(圖4、5)
理論基礎
腺核苷三磷酸 (Adenosine triphosphate,ATP )存在於動物、植物、細菌、
黴菌等生物細胞中,故ATP的含量能用於表示職場空氣中生物性危害的污染物數
量。1960年代美國太空總署發展出ATP生物冷光反應技術(ATP bioluminescence
technique),用以檢測ATP的含量。此法是一種快速檢測方法,其反應原理與螢
火蟲體發光反應相同,在螢光素(luciferin)與螢光素酶(luciferase)存在
下,使ATP與螢光素及螢光素酶作用產生螢光。其反應方程式如下所示:
由上述原理設計之ATP冷光儀,因其可快速得到檢測結果,故已廣泛使用於
職場環境衛生與清潔品質管控。本專題利用冷光試劑筆塗抹從衝擊式空氣採樣器
採集至培養皿之樣本,使其產生上述之化學反應,再插入ATP冷光儀中測量所釋
放之冷光 ,以此來定量ATP的數量。ATP冷光儀測量一個樣本所放出之冷光是以
RLU來表示,所測得之RLU值與ATP數量是成正比的,同時也直接地與樣本的生物
污染物質成正比。
設備及材料
1.ATP冷光儀及冷光試劑筆:MERCK、HY-LiTE 2;130101.0021 HY-Lite Refill
Pack(圖1)
2.無菌操作台:川富 NAA-130
3.電子天平: METTLER TOLEDO EL204/IC
4.高溫蒸氣滅菌鍋:TOMIN
5.雙頭可攜型衝擊式採樣器: 型號DUO SAS 360 (圖2)
6.培養箱:HSIN CHIEN XIANG A830960830
7.培養皿: 55mm無菌塑膠培養皿
8.培養基:胰蛋白大豆瓊脂培養基(Tryptic Soy Agar),培養基添加真菌抑制
劑
環己亞胺(Cycloheximide,100μg / mL)。
9.75 % 酒精:消毒擦拭用。
10.純水:Millipore
(圖3)
(圖4)
(圖5)
結果與討論
在上述之採樣地點共採樣46次,將二重覆採樣所測得之CFU與RLU值平均後,獲得的
23組結果列於表1。使用Excel繪出表1之CFU值與RLU值之散佈圖(圖6),另分析兩者
之相關係數為0.014255。故由所得結果可知CFU與RLU值之相關性很低,並無原先期待
之正比例相關性,且無法求得迴歸方程式來配適兩者數據間的線性關係。
ATP冷光儀在操作過程中,測出之RLU值與培養所得之CFU值並不完全呈現正比,探
究其原因,這些異常數據應與不同操作者在使用冷光儀時,冷光筆的搖晃力道與時間
有所差異所造成,所以使用人員的熟悉度及技巧須再改進。而本專題所採樣之地點空
氣菌落數過少,所測得之CFU及RLU值過低(圖7)。我國環保署室內空氣品質建議的第
一類特別需求場所中指出,學校及教育場所、兒童遊樂場所、醫療場所、老人或殘障
照護場所等區域,細菌的建議值範圍最高值為500CFU/m3;一般大眾聚集的公共場所及
辦公大樓,包括營業商場、交易市場、展覽場所、辦公大樓、地下街、大眾運輸工具
及車站等室內場所,細菌的建議值範圍最高值為1000CFU/m3。所以如要得到更客觀正
確的標準曲線用於職場之空氣檢測,需至空氣菌落較多的環境進行更多的採樣分析,
以提供高濃度菌落數及RLU值之數據群用於兩者相關性之分析。
最後,根據目前測得之現有數據,CFU與RLU值相關性低,無法獲得正確的線性方程
式來評估職場空氣之細菌菌落數。故更多高污染職場的採樣會持續進行,以補數據之
不足。
採樣區
CFU/m
某食品工廠
3
RLU
11
10
10
13
16
14
18
27
30
44
37
28
25
50
25
13
8
12
6
8
6
6
15
10
採樣區
CFU/m
某食品工廠
3
RLU
餐廳廚房 A
餐廳廚房 B
市場雞肉攤
38
55
30
59
57
10
6
3
12
48
40
6
3
12
48
40
28
38
55
30
59
57
表 1. 採樣所測得之 CFU 與 RLU 值
圖7.不同刻度間距之CFU值與RLU值散佈圖
圖6.CFU值與RLU值之散佈圖
70
500
60
400
300
40
RLU
RLU
50
30
200
20
100
10
(圖1)
(圖2)
0
0
0
10
20
30
40
CFU/m3
50
60
70
0
100
200
300
CFU/m3
400
500

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