Reaktif Oksijen Turevleri : Dost mu? Düşman mı?

Report
Reaktif Oksijen Türevleri
Dost mu? Düşman mı?
Prof. Dr. Esat Orhon
Gülhane Askeri Tıp Fakültesi
Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı
Üremeye Yardımcı Teknikler Ünitesi
İki ucu keskin kılıç
• Fizyolojik dozlar
• Hücre fonksiyonlarinin regülasyonu
• Sinyal iletimi
• Apoptozis
• Aşırı dozlarda
• Oksidatif stress.
Reaktif Oksijen Türevleri nedir?
Serbest Radikal nedir?
• Serbest radikal : Çift oluşturamamış, tek kalmış
elektron veya elektronlar içeren atom veya
molekül
• Çift arayan bu elektronlar son derece yüksek
enerjili olup, boşta kalmış tekli elektronlari çift
oluşturmak üzere ararlar
• Bunlara Reaktif Türevler denmesinin nedeni,
çift oluşturmak üzere yüksek enerjisi ile arayış
içinde olan bu serbest radikaller, protein, lipid ve
nükleik asit gibi biomoleküllerin yapısına girerek
bozabilmeleridir.
Unpaired Electrons
Neler Reaktif Oksijen Türevidir?
• Süperoksid anyonu (O2-.)
• Hidroksil (OH)
• Güçlü oksidanlar : Hidrojen Peroksid (H2O2)
• Peroksil radikalleri
• Alkoksil radikalleri
• Organik hidroperoksidleri
• Peroksinitrit
• Hipoklorik asid
• Nitrik oksid.
Serbest Radikaller : Zincir Reaksiyonu üreticisi
• Biolojik sistemlerde, normalde sadece çift elektronlar vardır
• Serbest radikaller ise, zincir reaksiyonlara neden olurlar;
• Ör : Biolojik membranlardaki lipidlerin peroksidasyonu
• Plazma membranı üzerindeki doymamış yağ asidlerine ROS atağı olur
• Bu atağın sonucunda Peroksil ve Alkoksil açığa çıkar
• Bu radikaller, stabilize olabilmek için bir H+ atomunu atarlar
• Böylece Organik hidroperoksidler ve Alkol oluşur
• Hidrojen atomunun atılması, bir başka lipid üzerinde karbonun oksijenle
birleşmesi ve başka bir lipid peroksid oluşturmasıyla sonuçlanır
• Yeni oluşan lipid peroksid, stabilize olmak için bir H+ atomunu atar, ve
zincir reaksiyon süreklilik kazanır
• Sonuçta, plazma membranının peroksidatif hasarı oluşur.
Spermler neden Reaktif Oksijen Türevleri’nin
hedefidir?
• Sperm membranı gerektiğinde sıvılaşabilmeli ve eriyebilmelidir
• Sperm – Oosit füzyonu için (akrozomal ekzositoz) bu gereklidir
• Bunu sağlayabilmek için sperm membranı doymamış yağ
asitlerinden çok zengindir (22:6)
• Bu da, spermleri peroksidatif ataklara karşı savunmasız kılar
• Peroksidatif atak durdurulabilir mi?
• Zincir reaksiyonu durdurabilecek tek anti-oksidan, -tokoferol (vit-E)
• Yüksek lipid peroksidasyonu nedeniyle subfertil olan erkeklerde, fertilite
bu tedavi fertiliteyi restore edebilir
• Antioksidan tedavi, selektif olarak sadece oxidatif stress nedeniyle
subfertil erkeklerde yararlıdır.
Erkek germ hücrelerinde ROS varlığı nasıl
tespit edilir?
• Biolojik sistemlerde oksijen metabolitlerinin
tespiti icin sensitif ve doğru sonuc veren bir test
henüz yoktur.
• Aitken’in tanımladığı lucigenin veya luminol
yöntemi kullanılabilir
• Lucigenin membran impermeabldir. + ion yükü
taşır ve extraseluler aralıkta O2- ’e cevap verir
• Kimyasal illuminesans testidir.
Sperm parametreleri ile lucigenin / luminol
kimyasal illuminesans ilişkisi - 1
•
Percoll gradient’in % 80-90’lık bölümünden alınan ve beyaz kürelerle
kontamine olan spermlerdeki morfoloji bozukluğu, motilite defektleri ve
sperm-oosit füzyon kapasitesi, luminol peorksidaz ile çok yakın ilişkili
bulunmuştur
•
Bu test, gunumuzde sensitif olup, doğru sonuç veren tek test olarak
önemini korumaktadır
•
Ancak zor ve kompleks bir test olmanin yanisira, hassas olmasi nedeniyle
bir çok faktörden etkilenebilmektedir
•
Ejakülasyon (kapasitasyon) – testin zaman aralığı
•
Likefaksiyon : İyi likefiye omayan semenlerde test iyi sonuç vermiyor
•
Bovin serum albumini : Poliamin oksidaz aktivitesi ile kontamindedir, ve
seminakl plazma ile temas ederse, yanlış sinyal verir.
•
Santrifügasyon : ROS üretimini arttırır
•
Ortam pH’ı : Test sonuçlarını çok yakından etkiler
•
Kimyasal illuminesans interferansı : Bir çok kimyasal madde, luminol
peroksidaz veya lucigenin etkileşimini artırır
•
Lökositler : Ortamdaki lökosit varlığı, testi doğrudan etkiler.
Sperm parametreleri ile lucigenin / luminol
kimyasal illuminesans ilişkisi - 2
Sperm parametreleri ile lucigenin / luminol
kimyasal illuminesans ilişkisi – 3
• Yüksek redox aktivitesi gösteren defektif
spermatozoalar, spermatogenik prosesteki
sorunlarin varlığını ve H2O2 üretme
kapasiteleri hakkında bilgi veriyor
• Baska arastirmalarla da konfirme edilen bu
bulgu, semen kalitesinin ROS’un ana
kaynağı olan sitoplazmik retansiyonların
varlığını ve ilişkisini göstermiştir.
Oksidatif stresin spermatoza üzerine etkisi - 1
• İlk kez 1979 yılında bu konu dikkati çekmiştir
• Jones et al, lipid peroksit varlığının ciddi motilite
kaybına yol açtığını bulmuşlardır
• Bu muhtemelen plasma membranının bütünlüğü
ve gerektiğinde sıvılaşabilme özelliğine sakip
olması ve bunun flagellar hareket ile yakın
ilgisinden kaynaklanmaktadır.
Oksidatif stresin spermatoza üzerine etkisi - 2
•
Oksidatif stres, aynı zamanda DNA hasarının da majör bir etkenidir
•
PCR çalışmaları göstermiştir ki, mitokondrial DNA, nükleer DNA’dan daha
fazla hasar görmektedir
•
Sperm mitokondrial genomumunun integritesi, oksidatif stresin çok iyi bir
göstergesidir
•
Ancak bunun biolojik bir önemi yoktur çünkü biliyoruz ki sperm
mitokondriası, fertilizasyondan sonra replike olmamaktadır
•
Ve yine biliyoruz ki, nükleer kromatin spermatozoa içinde paketlenmiş
durumdadır
•
Bu nedenle, erkek gamet genomu, oksidatif strese karşı rezistandır
•
Bunun doğru olduğunu şuradan da biliyoruz : Spermatozoa içindeki
kromatinin paketlenmiş durumundan dolayı, DNA hasarı yapacak düzeydeki
bir irradyasyonda, somatik hücreler etkilenirken, spermatozoa rezistan
kalabilmektedir.
Erkek genom yapısı - 1
•
Spermatozoanın diferansiyasyonu esnasında nükleer histonlar, daha küçük
boyutlu olan protaminlerle (arginine ve cysteine) yer değiştirir
•
Protaminler, küçük boyutlarından dolayı, çok küçük bir alan içinde
paketlenebilirler
•
Öteryan memelilerdeki spermindeki protaminler, epididmal transit sırasında,
sistein rezidüleri taşırlar ve nükleer kromatin yapısını stabilize eden disülfid
bağları oluşur
•
Bu stabilizasyon, spem DNA’sını oksidatif strese karşı dayanıklı hale getirir
•
Ancak öteryan memelileri içinde insan spermatozoası insan spermine has
P2 protamini bulundurur, ve bu protaminin düsülfid bağları oluşturabilecek
thiol grupları sınırlı sayıdadır
•
Ayrıca insan sperminin protaminasyonu yüksek etkinliğe sahip değildir.
•
Fertil erkeklerde bile, genomun % 15’i histon yapısını korur.
Erkek genom yapısı – 2
• Sperm kromatin paketi ne kadar protamin –
disülfid bağlarıyla kuvvetli oluşturulursa, DNA
hasarına karşı o kadar dirençli olur
• Testisler, insan spermatozoasındaki
protaminizasyonu ne kadar defektif yaparsa,
DNA hasar riski o kadar yükselir
• Sperm kromatin paketi ne kadar protamin –
disülfid bağlarıyla kuvvetli oluşturulursa, DNA
hasarına karşı o kadar dirençli olur.
Erkek genom yapısı ve Oksidatif stresin
spermatoza üzerine etkisi
• Her ne kadar teorik olarak insan spermatozoası oksidatif DNA
hasarına karşı dayanıklı gibi görünse de, somatik hücrelere kıyasla
daha fazla hasarlanırlar
• Bunun tek açıklaması erkek toksikolojisinde yatar
• İlerleyen yaşın olumsuz etkisi
• Meslek hastalıkları
• Sigara
• Oksidatif stres, doğrudan mutageik değişikliklere neden olmaz, daha
ziyade non-spesifik hasar yaratırlar (nükleotidler arası bağ
kırılmaları, DNA bazlarında değişiklikler, baz içermeyen alanlar)
• Oksidatif stres, plazma membranı üzerine de peroksidatif stres
yaratır.
DNA hasarının genetik mutasyonlara yol açması
• Sperm DNA hasarı yüksek olan erkeklerin çocuklarında
daha fazla kanser, şizofreni, dominant genetik
mutasyonlar görülmektedir
• DNA hasarı yüksek spermlerle elde edilen gebeliklerde,
infertilite ve tekrarlayan gebelik kayıpları da daha sık
görülmektedir
• Aslinda erkek germ hücrelerinde spontan genetik
mutasyonlar oldukça düşüktür
• Paternal kökenli patolojiler, erken embryo dönemindeki
DNA onarımının aberan (sorunlu) olmasındandır.
DNA hasarının fertiliteye etkileri
• Okisdatif stresin yüksek düzeylerinde, spermatozoanın
fertilizasyon kapasitesi kaybolur
• Oksidatif stresin düşük düzeylerinde, oosit sperm
tarafından fertilize edilebilir. Ancak bu durumda, birinci
klivajdan önce, hasarlı DNA oosit tarafından onarılmak
zorundadır
• Oosit vücudun en büyük hücresidir ve rekombinan bir
fabrikadır.
• Embryo döneminde sperm DNA erken
fragmantasyonlarını onarabilir
• Eğer sperm DNA fragmantasyonları % 30’u aşacak
olursa, bu oositin onarma kapasitesini aşar.
Defektif sperm üretilmesine yol açan
oksidatif stresin kaynağı nedir? - 1
•
Serbest radikal üreten lökositler : Nötrofiller
•
Eğer nötrofiller sekonder (aksesuar) seks organlarından (prostat, seminal
veziküller) kaynaklanıyorsa, seminal plazmanın güçlü anti-oksidan özelliği
spermleri korur
•
Askorbik asid
•
Ürik asid
•
Süperoksid dismutaz
•
Glutatyon peroksidaz
•
Eğer nötrofiller normal konsantrasyonda olursa, (~ 40,000/mL) seminal
plazmanın koruyucu etkisi yeterli olur
•
Ancak, eğer spermler, yoğun bir ortamda fazla miktarda nötrofillerle yan
yana bulunurlarsa, ve seminal plazma da bu ortamda yok ise, o zaman
oksidatif stres etkili olur ve genomik bütünlük bozulabilir
•
Santrifügasyon buna tipik bir örnektir.
Defektif sperm üretilmesine yol açan
oksidatif stresin kaynağı nedir? – 2
• Eğer nötrofiller vaz deferensten daha
proksimal bir bölgeden erkek genital
traktusuna girmişlerse, (testisler, vaz
deferens) spermatozoaya oksidatif stres
yaratacakları kuşkusuzdur
• Bu durumda küçük konsatntrasyonlardaki
nötrofiller dahi hasar yaratabilir.
Reaktif oksijen türevlerinin fizyolojik rolü nedir?
• Eğer ROS spermatozoa üzerine bu derece zaralı
ise, neden hücrelerimiz yüksek reaktiviteye
sahip moleküller oluşturmaktadır?
• Bunun cevabı çok iyi bilinmemekle birlikte
cevabın, memeli spermatozoasının
kapasitasyonunda yattığı düşünülmektedir
• Kapasitasyon spermin matürasyonudur. Ancak
bu matürasyon gerçekleşirse sperm – oosit
interaksiyonu oluşabilir.
Kapasitasyon nedir? ROS’un yararı nedir?
• Kapasitasyonun en karakteristik özelliği trozin
fosforilasyonu’nun dramatik düzeyde artmasıdır
• Bunun sinyali cAMP tarafından verilir
• ROS, intraselüler adenil siklaz aktivitesini stimüle eder
• Ayrica ROS, özellikle H2O2, tirozin fosfataz aktivitesini
süprese ederek, tirozin fosforilasyonunu arttırır
• H2O2 bunu sistein üzerinden yapar. H2O2, tirozin fosfataz
ile karşılaşırsa, emzimin içinde bulunan sisteini okside
ederek tirozin fosfatazı dramatik bir sekilde inhibe eder.
H2O2 yararlı mıdır?
•
Eğer H2O2 doğrudan insan semeni üzerine ilave edilirse, tirozin
fosforilasyonu ve kapasitasyon stimüle olur
•
Ortama katalaz ilave edilirse, bu reaksiyon geri döner
•
Katalaz, tirozin fosforilasyonunu inhibe eder
•
Katalaz, ayni zamanda sperm hiperaktivasyonunu, akrozom reaksiyonunu
ve sperm-oosit füzyonunu süprese eder
•
Spermlerin bulundugu ortama lökosit ilave edilecek olursa, yine
kapasitasyon stimule olur
•
Bu reaksiyon da, seminal plazmada bulunan anti-oksidanlarla geri
dondurulebilir
•
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH)’da tirozin fosforilasyonunu
ve sperm kapasitasyonunu arttırır
•
Ortama NADPH ilave edilirse, O2-. üretimi olmamaktadır
•
Ortama katalaz ilave edilirse, NADPH’ın tirozin fosforilasyonunu arttirici
etkis ve kapasitasyon başlatıcı etkisi inhibe olur.
NADPH nedir?
• Heksoz monofosfat varlıgında üretilir
• NADPH oksidaz, ROS üretimine yol açar
• Gerek kapasitasyon ve gerekse ROS üretiminin
her ikisi de glukoz varlığında mümkündür
• Gerek kapasitasyon ve gerekse ROS üretiminin
her ikisi de glukoz analoğu ile bloke edilebilir
• Glukoz-6 PDH, ROS üretimini arttır, heksoz
monofosfat üretimini kontrol eder.
Olgun spermatozoa nedir?
• Olgun spermatozoa, minimal sitoplazma içerir
• Minimal sitoplazma sınırlı miktarlarda ROS
üretimi yapar.
• İmmatür spermatozoa gereğinden fazla
sitoplazma bulunduracağı için, gereğinden
fazla NADPH ve ROS üretimi olur
ÖZET
 ROS  intraselüler cAMP + NADPH  tirozin fosforilasyonu  kapasitasyon
➨ ROS ➨ plazma membraınındaki doymamış yağ asitlerinin lipid
peroksidasyonu ➨
➨ Membran fonksiyonlarıyla ilgili tüm görevlerde
bozulma (motilite, sperm-oosit füzyonu) +
Nükleer DNA ve mitokondrial DNA hasarı ➨
Subfertilite + Tekrarlayan gebelik kayıpları

similar documents