PCR检测转基因大豆玉米

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实验九 PCR扩增检测转基因大豆、玉米
【实验目的】

通过PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米
产品是否含有转基因成分

培养学生的实验设计能力和创新能力
【实验原理】
以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin)
基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参,
花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、
农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及
外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中的转
基因成分。
【实验步骤】
大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法

称取0.1g样品,在研钵中充分研磨。加入1000μL CTAB提取液,
继续研磨充分后加入到1.5mL Ep管中;向EP管加入4μL RNaseA,
至于65℃水浴,过程中混匀3~5次,30min,12000r/min室温离心
10min;取上清于新的Ep管中,加入等体积氯仿:异戊醇(24: 1),
轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混匀),室温静置5min,室温
12000r/min离心10min;重复加入氯仿异戊醇一到两次 (过程中如
上清液量太少,可适量加入三重蒸馏水);取上清于新的Ep管(千
万不要吸入下层液体),再加入等体积的CTAB沉淀液,轻缓颠
倒混匀后室温静置1h,15000 r/min室温离心10min;弃上清液,
加入400μL 1.2mol/L氯化钠溶解沉淀,56℃温浴15min,期间轻
摇EP管数次助溶;加入800μL -20℃无水乙醇,-20℃静置1h,
15000 r/min室温离心10min;弃上清液,用75%乙醇洗涤沉淀两
三次后,在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于4℃。
【实验步骤】
基因组DNA浓度和纯度的鉴定

取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中,用 Biophotometer分
析DNA的浓度,通过它对提取大豆DNA测OD值。并记
录数据。由OD260nm/OD280nm判定基因组DNA的浓度,
其比值在1.7~2.0之间较好,符合PCR检测要求。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是
一种选择性体外扩增DNA的方法,其基本原理类
似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 。 它 包 括 : 变 性
(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基
本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环,理论上
每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成
产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经
25~35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
检测基因
引物序列
扩增片段长度
基因性质
大豆 Lectin
p1:5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c3’
p2:5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg3’(54 ℃)
118 bp
内源基因
226 bp
内源基因
195 bp
外源基因
玉米 IVR
CaMV 35S
p3:5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc3’
p4:5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc3’ (56℃)
p5:5’-gat agt ggg att gtg cgt ca-3’
p6:5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’
(54 ℃)
NOS
p7:5’-gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3’
p8:5’-tta tcc tag ttt gcg cgg ta-3’
(54 ℃)
180 bp
外源基因
CP4 EPSPS
p9:5’-ctt ctg tgc tgt agc cac tga
tgc-3’
p10:5’-cca cta tcc ttc gca aga ccc
ttc c-3’ (56 ℃)
320 bp
外源基因
主要试剂
Taq DNA polymerase
引物对:1μmol/L
底物:10mMdNTP
PCR缓冲液
ddH2O
主要实验器材
PCR主要操作步骤

标记试管

加入各种试剂、混匀、离心(最后加酶)

设立PCR循环程序,进行扩增
标记PCR反应管
加入试剂
【实验步骤】

1. 在0.2 mL Eppendorff管内调制50 μL反应体系:
反应物
dd H2O
PCR缓冲液 (10×)
dNTP (2.5mM each)
引物1
引物2
Taq DNA聚合酶
模板DNA
体积(μL)
37.5
5
4
1
1
0.5
1
反应管放入PCR仪
编辑程序进行扩增
PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。
2. 按下述程序进行PCR扩增:







1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
94℃ 预变性 3 min;
94℃ 变性 1 min;
54℃ ( 或者56℃ )退火 45 sec;
72℃ 延伸 1 min;
重复步骤2~4, 29次;
72℃ 延伸 10 min;
End.
3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果

配制0.8%琼脂糖凝胶,取PCR产物5μL
加 1μL 点 样 液 混 合 后 点 入 上 样 孔 , 于
120V电压电泳20~30min。电泳结束后,
用自动凝胶成像分析系统检测
M 1 2 3 4 5 6 7
内源基因(Lectin)特异性扩增
M 1 234 5 6 7
外源基因( EPSPS)特异性扩增
1 2 3 4 5 6 7 M
M 1 2 3 4 5 6 7
1
外源终止子(NOS) 特异性扩增
2
外源启动子(CaMV35S)特
异性扩增
1 未加模板对照 2 转基因大豆、玉米
3~7 非转基因大豆、玉米
PCR假阳性结果
1. 引物设计不当,应调换引物
2. 循环参数不合适,导致非特异性扩增
3. 靶序列的交叉污染
PCR假阴性结果
1. 模板问题
2. 试剂浓度不够
3. 标本中有Taq酶的抑制剂
4. PCR产物检测系统灵敏度不够
【注意事项】
1 提取高质量的模板DNA是PCR成功的
决定因素之一
2 注意防止试剂的交叉污染
五 结果处理
分析PCR产物电泳结果,判断所测样品是否含
转基因成分。
【思考题】


1、影响PCR反应效率的因素有哪些?
2、为什么检测转基因大豆或者玉米时,以
大豆凝集素(Lectin)基因、玉米特异性内源基
因IVR为内参 ?

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