Diagnóstico Laboratorial de Leptospirose: Testes de triagem e

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Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem
e confirmação
I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento
Marluce Aparecida Assunção Oliveira
Bióloga, Especialista em Microbiolgia
Especialista em Gestão Institucional - MBA
Mestre em Ciências Biológicas - Microbiologia
Doutoranda em Ciências da Saúde - Infectologia e Medicina Tropical
Chefe do Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas
Fundação Ezequiel Dias - LACEN/MG
Antígenos versus Anticorpos
Leptospira spp.
Resposta imune a Leptospira spp.
Sorovar específica
• Resposta predominantemente humoral
(anticorpos).
Antigenicidade
• Atígenos de superfície
(LPS);
• Compartilhamento de antígenos.
Evolução da resposta humoral (anticorpos)
Escala de tempo
10
semana
Concentração
de anticorpos
20
semana
30
semana
40
semana
meses
anos
IgM
IgG
Diagnóstico
sorológico
Fases
Bacteremia
Imunidade
Bacteriuria
Isolamento e PCR
(adap. Royal Tropical Institute, Netherlands)
Diagnóstico Laboratorial
1ª fase da doença ou fase leptospirêmica (04 - 07dias).
• Cultivo.
• Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
2ª fase da doença ou fase imunogênica (04 - 30 dias).
• Pesquisa em campo escuro.
• MAT (Teste de aglutinação microscópica).
• ELISA (Ensaio imunoenzimático).
• PCR (Reação em cadeia da polimerase).
Cultura de Leptospira spp.
O isolamento de leptospiras
depende do material
biológico de escolha e do
tempo de evolução da
doença.
Cultivo de Leptospira spp.
Meio líquido
Meio semi-sólido
Hemocultura
• Exame qualitativo
• Fase de leptospiremia: primeiros 10 dias de doença 
antes do início da antibióticoterapia;
• Coleta em condições assépticas;
• 1,2 e 3 gotas de sangue total em três respectivos tubos;
• Incubação 28-30oC / abrigo da luz / aprox. 4 meses;
• Acompanhamento semanal por microscopia de campo
escuro.
5 mL meio de
cultura semi sólido
Sorovares e cepas - Microaglutinação.
SOROVARES
andamana
australis
autumnalis
ballum
bataviae
bratislava
canicola
castellonis
celledoni
cynopteri
copenhageni
djasiman
grippothyphosa
hardjo
hebdomadis
icterohaemorrhgiae
javanica
panama
patoc
pomona
pyrogenes
shermani
tarassovi
wolffi
CEPAS
CH 11
Ballico
Akiyami A
Mus-127
Swart
Jez Bratislava
Hond Utrecht
Castellon 3
Celledoni
3522 C
M20
Djasiman
Moskva V
Hardjoprajitno
Hebdomadis
Icterohaemorrhgiae-RGA
Veldrat Batavia 46
CZ 214 K
Paatoc-I
Pomona
Salinem
1342 K
Perepelitssin
3705
Meio líquido
Triagem - Exame qualitativo.
Leitura após incubação. Preparo da
lâmina para visualização das
reações de cada sorovar/paciente
Leitura microscópica
Visualização microscópica
Microscopia de campo escuro (leitura):
Sem aglutinação
25% aglutinado
75% aglutinado
100% aglutinado
50% aglutinado
Titulação - Exame quantitativo
1:100, 1:200, 1:400 ..... ..... ......
1:25.600
Soro
1709
CN
100L
100L
100L
100L
100L
100L
100L
100L
100L 100L
100L
Autum.
Astralis
Canic.
Hardjo
Icteroh.
Patoc
Wolffi
Taras.
CN = 100 l PBS + sorovar a ser titulado.
100 l soro diluído 1:50 + 100 l sorovar a ser titulado.
100L
ELISA-IgM para o diagnóstico de leptospira
• Fase sólida com antígeno ou anticorpo mobilizado;
• conjugado (ante imunoglobulina humana ligado a uma enzima);
• adição do substrato;
• formação de cor;
• leitura por espectrofotometria (determina a relação entre a
intensidade da cor e a quantidade do que está sendo medido).
ELISA - exame qualitativo
Perfil de reatividade - MAT e ELISA-IgM
36,1%
22,3%
Numero de soros
positivos/2009
14,4%
17,2%
7,8%
2,2%

Perfil de reatividade
 ELISA - IgM reagente e MAT ≥ 800.
 ELISA - IgM reagente e MAT reagente ≤ 800.
 ELISA - IgM reagente.
 ELISA indeterminada e MAT reagente ≤ 800.
 ELISA indeterminada.
 ELISA - IgM não reagente e MAT reagente ≤ 800
(IgM e IgG).
MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM
ELISA IgM Sensibilidade
100%
ELISA IgM Especificidade
86 %
ELISA IgM Valor Preditivo Positivo
71%
ELISA IgM Valor Preditivo Negativo
100%
MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM
ELISA IgM Sensibilidade
99,5% (IC 95% 98,0-100,0%)
ELISA IgM Especificidade
90,0% (IC 95% 88,5-91,5)
ELISA IgM Valor Preditivo
Positivo
74,5% (IC 95% 66,7-80,9%)
ELISA IgM Valor Preditivo
Negativo
99,8% (IC 95% 99,1-100%)
Concordância
92,3% (IC95% 89,6-94,4%).
Amostras com diagnóstico diferencial
600
500
127
95
400
300
COM DIAG.
DIFERENCIAL
200
SEM DIAG.
DIFERENCIAL
427
445
PANBIO
BIOMANGUINHOS
100
0
KIT ELISA - IgM Panbio
2%
9%
89%
REAGENTE
INDETERMINADO
NÃO REAGENTE
N= 127 (R-11; I-2; NR-114)
ELISA- IgM BIOMANGUINHOS x MAT
IN
DO
CO
ELISA
MAT
DF
9
0,429
0,261
REAGENTE
andamana1/200; ballum1/100;
shermani1/400; tarassovi1/400;
FEBRE MACULOSA
IgM: IFI REAGENTE
3
0,636
0,224
REAGENTE
andamana1/200; australis1/100;
ballum1/100; bratislava1/100;
sejroe1/100; hardjo1/100;
icterohaemorrhagiae1/100;
patoc1/100; tarassovi1/800
HEPATITE C (ANTIHCV): ELISA
REAGENTE
23
0,183
0,163
REAGENTE
NÃO REAGENTE
LEISHMANIOSE
VISCERAL : IFI
REAGENTE
14
0,299
0,163
REAGENTE
NÃO REAGENTE
FEBRE MACULOSA
IgG: IFI REAGENTE
9
0,2
0,163
REAGENTE
NÃO REAGENTE
LEISHMANIOSE
VISCERAL : IFI
REAGENTE
IN: curso da doença; DO: leitura do teste; CO ponto de corte; DF: diagnóstico diferencial.
Conclusões
• Baseado no VPN : o método de ELISA - IgM é um bom
método para triagem de amostras de pacientes com suspeita
de leptospirose diminuindo assim o número de amostras
examinadas pelo método de microaglutinação .
• É necessário a realização da microaglutinação para todas as
amostras que apresentarem resultados indeterminado ou
reagente na ELISA - IgM.
• Quando expandido o intervalo entre inicio de sintomas e data
de coleta, verificamos maior sensibilidade da ELISA - IgM,
assim, todo amostra coletada antes de 10 dias de curso da
doença deverá ser encaminhada 2ª amostra após uma semana
da data da coleta da 1ª.
Diagnóstico de Leptospirose - Lacen MG (desde 2011)
-Todas as amostras (soro) de pacientes com suspeitas
de leptospirose são analisadas (triadas) pelo método
ELISA-IgM.
-Somente as amostras (soro) que apresentarem
resultados indeterminado ou reagente quando
analisadas pelo método de ELISA-IgM serão analisadas
pelo método de Aglutinação Microscópica (MAT).
-Amostras (soro) de pacientes com um mês ou mais de
início de sintomas serão processadas as duas
metodologias, ELISA-IgM e MAT.
Obrigada
Diagnóstico de Leptospirose
(desde 2011)
- Todos os laudos que apresentarem resultados não
reagente para leptospirose constarão apenas a
descrição do resultado do ELISA-IgM, os que
apresentarem resultados indeterminados ou reagente
pelo método de ELISA-IgM constarão da descrição dos
resultados do ELISA-IgM e MAT.
-Todas
as
amostras
(soro)
devem
ser
encaminhadas juntamente com a ficha SINAN,
e a data de coleta e início de sintomas são
informações fundamentais para a análise dos
resultados
laboratoriais,
portanto,
de
preenchimento obrigatório. [email protected]
Sempre que possível ofereça flores.

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