representación de Eadie-Hofstee

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Tema: 12. Obtención y análisis de datos cinéticos.
1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten:
1.1. Orden cero de reacción
1.2 . Orden uno de reacción
1.3. Orden mixto de reacción
2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten:
2.1. Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk.
2.2. Representación de Hanes
2.3. Representación de Eadie-Hofstee.
2.4. Representación lineal directa o representación de Einsenthal y
Cornish-Bowden
1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten:
Estudio de acuerdo con el orden de reacción
Dependencia de la velocidad con respecto a la [S]
1.1. Orden cero de reacción
 dS  V max dt
St  So  V maxt
v
v  V max
dS
S
 V max  V max
dt
S
S>>>Km
10 veces la Km
Integrando entre So y St y entre 0 y t
Permite comparar cantidades totales de enzima
Vmax1= kcat [E01]
Vmax2= kcat [E02]
E01   V max1
E02  V max 2
La razón de las cantidades de enzima es proporcional a la razón de velocidades
máximas o de las actividades enzimáticas obtenidas experimentalmente
Comparar cantidades de una misma enzima de un tejido o en
circunstancias metabólicas diversas, diferenciación, patologías, etc
S 
Km  S 
v  V max
1.2. Orden uno de reacción
v
dS
S
 V max
dt
Km
S 
Km  S 
S<<<<Km
A concentraciones 1/10 Km
dS V max t Integrando entre S0 y St


dt

So S
0
Km
V max
 ln St  ln So 
t
Km
So V max
ln

t
Obtener el valor de Vmax/Km
St
Km
St
St  So  e
V max
t
Km
Conociendo cantidad incial de
enzima [Eo] puede obtenerse la
constante de especificidad (kcat/Km)
1.3. Orden mixto de reacción
dS
S
v
 V max
dt
Km  S
Km  S
 dS
 V max dt
S
St dS
St
t
 Km 
  ds  V max  dt
So dt
So
0
St
 Km ln
 So  St   V max t
So
v  V max
S ≈ Km
1 So
ln
t St
Dividiendo los dos términos por Km y por t
1 So V max 1 ( So  St )
ln


t St
Km
Km
t
1
m
Km
Vmax
( So  St )
t
Linearización de la ecuación
integrada de M-M a S ≈ Km
Estudiando el avance de una sola reacción cuando
estamos en orden mixto se pueden obtener:
Vmax y Km
S 
Km  S 
2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten
Lo primero es obtener los correspondientes parámetros cinéticos.
Para obtener los parámetros cinéticos de una enzima lo que solemos hacer
es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones de S.
v
Vmax

S
v  V max
Km  S 
[S]
v frente a [S]
P
Imaginemos que estamos estudiando una reacción S  P
catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1)
vo(mmol L-1 min-1)
0,30
0,57
0,50
0,85
0,75
1,18
1,50
1,82
3,00
2,50
7,50
3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representación V  [S].
Calcúlenlo ahora y escriban sus resultados en la
pizarra.
Analicen los datos.
¿Alguna conclusión?
Como acabamos de ver la representación de v frente a
[S] es poco útil para estos fines, debido a:
- la dificultad para dibujar con precisión una hipérbola
rectangular
- la dificultad para encontrar las asíntotas (Vmax), de
manera correcta, y consecuentemente para calcular Km
* Estas dificultades, fueron ya tenidas en cuenta por Michaelis y
Menten, quienes intentaron representar v frente a log[S]. Esta
representación tiene ciertas ventajas, aparte de su valor histórico,
pero debido a su poco éxito, en la bioquímica moderna, no
comentaremos nada más sobre ella.
Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con
mayor fiabilidad, se han propuesto varios procedimientos o
métodos. La mayoría de ellos basados en la linealización de la
ecuación de Michaelis-Menten
Quizás las tres representaciones más usadas sean:
- Representación de Linenweaver-Burk o de dobles inversos
(1/v  1/[S])
- Representación de Hanes ([S]/v  [S])
- Representación de Eadie-Hofstee (v  v/[S])
Además de estas tres representaciones, basadas en la
linealización de la ec. de M&M, existe una curta basada en la
representación directa v  [S], o representación de Einsenthal y
Cornish-Bowden.
2.1.Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk
- Si escribimos la ecuación de Michaelis-Menten en su forma inversa,
obtenemos:
1 S  Km 

v V max S
1
S
Km


v V max S V max S
1
1
Km
1
---- = ------------- + ------------- ---------
v
y
Vmax
=
b
Vmax
+
m
[S]
x
1/v
a
m =Km/Vmax
-Pendiente Km/Vmax
- 1/Km
-Corte en el eje-x  1/v =0
-1/Km
-Corte en el eje-y 1/[S] =0
1/Vmax
1/Vmax
1/[S]
La representación más utilizada, no es la más recomendable ya que da
impresiones extremadamente engañosas de los errores experimentales: así para
pequeños valores de v, pequeños errores en la medida de v, conducen a grandes
errores en 1/v, mientras que para valores grandes de v los mismo pequeños
errores en la medida de v conducen a errores apenas apreciables en 1/v.
1/v
1/[S])
2.2. Representación de Hanes
Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,
1
1
Km 1 

 
  S 
 v V max V max S  
S  
v

Km
S

V max V max
La representación de [S]/v frente a [S], da una recta:
S   
v
Km   1 


S 
 V max   V max 
y
=
b
+
m
x
- Esta representación se conoce como representación de
Hanes, representación de Woolf o de Hanes-Woolf.
[S]/v
Pendiente = 1/Vmax
corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax,
corta en el eje [S] en un punto = - Km
a
m = tga = 1/Vmax
- Km
Km/Vmax
[S]
¿Cómo afectarán los errores de medida de la velocidad de
reacción en esta representación?
* En esta representación, como puede verse en la siguiente figura, los errores en [S]/v
son un reflejo mucho más fiel de los errores cometidos al medir el valor de v. Por este
motivo, la representación de Hanes es preferible a otras linealizaciones de la ecuación
de Michaelis-Menten.
[S]/v
[S]
Tarea 1 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S 
P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1)
vo(mmol L-1 min-1)
0,30
0,57
0,50
0,85
0,75
1,18
1,50
1,82
3,00
2,50
7,50
3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representación de Hanes.
2.3.Representación de Eadie-Hofstee.
1
1
Km 1 

 
  vV max
 v V max V max S  
Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax
obtenemos,
Vmax = v + (Km v)/[S]
y reordenando
v
v  V max Km
S 
y =
b
-
m
x
Esta representación se conoce como representación
de Eadie-Hofstee
v
Vmax
m = tga = -Km
a
Vmax/Km
v/[S]
La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:
- pendiente = -Km
- corte en el eje v = Vmax
- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km
Aspectos Positivos
v
Esta representación en general proporciona resultados
realmente buenos, ya que v aparece en ambas coordenadas
como factor multiplicativo, por lo que los errores cometidos en la
medida de v, harán que la curva se acerque o aleje del origen en
lugar de hacerlo paralelamente al eje de ordenadas.
Aspectos Negativos
v/[S]
Esta representación, contrariamente a la
de dobles inversos que hace aparecer
como buenos malos resultados, hace
aparecer como malos, buenos resultados,
dificultando grandemente el ocultamiento
de puntos que se desvíen de la recta.
Por lo que esta representación es la más
adecuada para el estudio de comportamientos
que se desvíen del modelo de Michaelis-Menten.
Tarea 2 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S 
P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1)
vo(mmol L-1 min-1)
0,30
0,57
0,50
0,85
0,75
1,18
1,50
1,82
3,00
2,50
7,50
3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representación de Eadie-Hofstee.
2.4.Representación lineal directa o representación de Einsenthal
y Cornish-Bowden
Independientemente, en 1974:
- J. Jiménez Vargas y J.M. Macarulla. Fisicoquímica Fisiológica,
Interamericana (4ª Edición), Madrid, (1974)
- R. Eisenthal y A. Cornish-Bowden. Biochem J., 139, 715-720,
(1974)
* Publicaron un procedimiento, totalmente diferente a los
anteriores, para la obtención de Vmax y Km, conocido como
representación lineal directa.
- La ecuación de M y M podemos transformarla en la ecuación
canónica de una recta en la que tratamos a Vmax y Km como
variables, y a [S] y v como constantes,
Si r es la recta que pasa por los puntos (a, 0) y (0,b), la ecuación la podemos escribir
Dividiendo por v(S)
V maxS 
v
Km  S 
vKm  S   V maxS 
Km
V max
1 
S 
v
Reordenando,
V max Km

1
v
S
Si el primer par de valores observados de v y [S] son v1 y [S1] y
representamos la recta que definen:
Vmax
v1
-S1
Km
Si tomamos ahora un segundo par de valores observados:
v2 y (S2), ....
Vmax
v2
v1
-S2
-S1
Km
Y luego un tercer par: v3 y (S3), ....
Vmax
(Km, Vmax)
v3
v2
v1
-S3 -S2
-S1
Km
- Como podemos observar, las distintas rectas se cortan,
intersecan, en un punto, común a todas ellas, de coordenadas
(Km, Vmax).
NOTA: Experimentalmente, de manera general, no obtendremos
un punto, si no un entorno de puntos, y la media de las
coordenadas de estos puntos nos dará el valor medio de Km y
Vmax con sus correspondientes desviaciones estándar.
Vmax
(Km, Vmax)
v3
v2
v1
-S3 -S2
-S1
- El número máximo de puntos de corte vendrá dado por: [n(n-1)]/2,
donde n es el número de rectas.
Km
Tarea 3. Suponga que estamos estudiando una enzima E que
cataliza la reacción S  P, y que obtenemos los siguientes datos
experimentales:
Concentración inicial
de sustrato (mmol L-1)
5,0
6,5
10,0
20,0
40,0
Concentración de producto (mmol L-1)
a distintos tiempos (t = min)
t=0
t=1
t=2
t=3
t=4
0
150 300 450 600
0
180 360 540 720
0
235 470 705 940
0
325 650 975 1300
0
410 820 1230 1640
Calcular Km y Vmax utilizando todos los procedimientos
estudiados.
Resumen
Estudiada la ecuación de Michelis-Menten de acuerdo con el orden de reacción podemos
encontrar las siguientes circunstanciasa) A concentraciones saturantes de substrato nos encontramos en el orden cero de reacción
La comparación de actividades enzimáticas en ordén cero de reacción puede servir para
comparar cantidades de una misma enzima en diferentes circunstancias metabólicas.
b) A concentraciones de substrato menores que un décimo de la constante de Michaelis, nos
encontramos en orden uno de reacción.
c) A concentraciones de substrato del orden de la constante de Michaelis es posible obtener una
ecuación a partir de la ecuación integrada de Michaelis-Menten permite determinar
graficamente los parámetros dinéticos Vmax y Km estudiando la curva del avance de una
reacción con respecto al tiempo
La ecuación de Michaelis-Menten es una cónica, hipérbola que pasa por el centro de coordenadas
v:S, cuya asintota paralela al eje de las abcisas representa la velocidad máxima.
Diferentes transformaciones algebráicas permiten la linealización de la ecuación de M-M para
una determinación más fácil de los parámetros Vmax y Km.
Entre estas se encuentran:
Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk.
Representación de Hanes
Representación de Eadie-Hofstee
Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden

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