遗传学实验 - 宁波大学生命科学与生物工程实验教学中心

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遗传与育种学实验
宁波大学生命科学与生物工程学院
实验目录
• 实验一:减数分裂的观察
• 实验二:核型分析
• 实验三:同工酶技术
• 实验四:遗传平衡定律
实验一:减数分裂的观察
• 实验目的:掌握减数分裂制片方法和技术;
观察并熟悉减数分裂各期染色体的特征。
• 材料:蝗虫精巢
• 步骤:
捕捉雄性蝗虫,解剖取出精巢,Carnoy固定液(无水乙
醇: 冰醋酸=3:1)固定三小时,70%酒精保存。实验时先在
一张干净的载玻片上滴1滴醋酸洋红,然后取一根精细管,
放在醋酸洋红染液中染色5-10分钟,盖上盖玻片后压片
(指压法,笔头敲击)观察。
注意压片时要小心,避免压破玻片,并尽量使材料散开,
以免细胞重叠影响观察。
减数分裂各期特征:
前期I:
1、细线期特点:染色质凝集,染色体呈
细长单条线状,盘绕成团,此时染色体已经
过复制,但看不出是成双的。
2、偶线期特点:各对同源染色体配对
(联会),结果细胞中的染色体由2n单价体
变成了n条二价体。
1、细线期和2、偶线期
3、粗线期特点:又称重组期,开始于同源
染色体配对完成后,n个染色体(配对的染色体称
二价体)进一步变短变粗,SC(联会复合体)仍
然存在,同源染色体的非姊妹染色体间可以发生
局部交叉和交换,核仁大。
3、粗线期
4、双线期特点:又称合成期,可见四分体。
染色体进一步缩短,组成二价体的两条同源染色
体表现相斥而分离,但由于同源染色体之间的交
换尚未完成,因而在不同的二价体上,在不同的
部位,不同程度出现交叉现象,使二价体成为“X、
V、8、0”等形状。
4、双线期
5、终变期特点:又称再凝集期。四分
体较均匀地分布在核中,交叉向染色体臂
的端部移行,称为端化。染色体凝集成短
棒状。
5、终变期
中期I:
纺锤体形成,排在赤道板上的二价体开始
分离,交叉端移。
后期I:
二价
体中的同
源染色体
分开,真
正减数。
末期I:
前期II:
中期II:具有两个染色单体的染色体
排在赤道板上。
后期II:
着丝粒纵裂,姐妹染色单体分开。
末期:染色体解旋,核膜重建等。
实验报告
• 根据你所观察的结果绘制蝗虫精巢减数分
裂过程中的染色体图像
实验二:核型分析
• 实验目的:
掌握骨髓细胞染色体标本的制备技术;
了解和掌握染色体核型分析的方法。
• 实验原理:
秋水仙素是一种生物碱,它能抑制细胞分裂时
纺锤体的形成,使染色体不走向两极而被阻止在分
裂中期,这样细胞就不能继续分裂,从而产生染色
体数目加倍的核。若染色体加倍的细胞继续分裂,
就能形成多倍性的组织。通过一定的方法,将染色
体制成片子,就能在显微镜下观察和鉴定染色体的
数目。
实验步骤:
• 牛蛙按30微克/克体重的剂量经腹腔注射秋水仙素,
15-16h(如果不诱导多倍体只需7-8h)后以解剖
针破坏牛蛙脑脊髓的方式处死牛蛙。
• 迅速解剖牛蛙取后肢的胫骨和股骨,剔除附着的肌肉,
然后剪掉骨头两端。
• 用注射器将约1ml 1% 柠檬酸钠注入骨髓腔,将骨髓
细胞连同组织冲入离心管,用注射器反复抽打骨髓,
使细胞团块分散。
• 2000 r/min离心5 min。
实验步骤
• 向离心管内加入0.075M KCl,使总量为10ml左右,
室温(或37 ℃ )静置低渗处理40min。
• 2000 r/min离心5 min。
• 弃上清液,沿管壁缓慢加入新配制的甲醇:冰醋
酸(3:1)固定液约5 ml,加完后用吸管将细胞
团轻轻吸打均匀,静置固定20 min。
• 2000 r/min离心5 min。
• 再加固定液固定20 min 。
实验步骤
• 离心弃上清液后,加入约1.5 ml新固定液,将
细胞团吸打成细胞悬液。
• 在干净、预冷的载玻片上滴2-3滴细胞悬液,
干燥。
• 用1:10(Giemsa原液:磷酸缓冲液)染色液
覆盖细胞染色8~15 min。
• 细流洗掉染色液,干燥后镜检。
实验报告
• 根据牛蛙染色体照片进行核型分析
核型分析方法
• 对放大的牛蛙染色体照片进行相关参数的测量
• 臂率=长臂/短臂
• 着丝粒指数=(短臂/该染色体长度)×100
• 相对长度=(每条染色体长度/总长度)×100
• 总长度=该细胞单倍体全部染色体长度之和
核型分析方法
• 分类
根据臂率值确定染色体着丝粒位置,进而依照着
丝粒的位置将染色体分为四类:
臂率
染色体类型
代表符号
1.0---1.7
中间着丝粒染色体
M
1.7---3.0
亚中间着丝粒染色体
SM
3.0---7.0
亚端部着丝粒染色体
ST
7.0以上
端部着丝粒染色体
T
核型分析方法
• 配对
•
•
根据测量数据,比较染色体的形状、大小、相
对长度、臂比、着丝粒指数、随体的有无等特征,
对照片上的染色体进行粗剪和同源染色体配对。
排列。
将配对的染色体按由大到小的顺序粘贴排列在实验
报告纸上,对于等长的染色体,短臂长的排在前面。
• 排列时短臂在上,长臂在下。
• 着丝粒排在同一条直线上。
实验三:同工酶技术
实验目的:
• 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
• 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术
• 理解同工酶的概念及遗传学意义
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交
联剂又称为共聚体的N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)
在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构
的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳为聚丙烯酰胺凝胶
电泳
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
(PAGE)。
聚丙烯酰胺凝胶的优点:
1)化学性能稳定,对pH和温度变化不敏感;
2)重复性好;
3)灵敏度高,可达10-6 g;
4)分辨率高。
原理:
聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中上层浓缩胶和下层分
离胶由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯
度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动有:
(1)电荷效应;
(2)分子筛效;
(3)还具有浓缩效应:较厚的蛋白质加样层可以被浓缩
成很薄的蛋白质层。
因而分离条带清晰度及分辨率佳。
同工酶是指能够催化相同的化学反应,但酶分子结
构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。
它们是由遗传体系决定的即相同的基因在不同组织
中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不
同.由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的差异,在电
泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。
生物体内存在多种同工酶,其中最经典的是乳酸脱
氢酶(Lactate Dehydrogenase)简称LDH。
试剂:
(1)凝胶缓冲液:称取1mol/L HCl 48 mL,Tris(三羟基氨基甲烷)
36.6g,TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)0.23mL,加重蒸水至
80mL使其溶解,调pH8.9,然后加重蒸水定容至100mL,置棕色瓶,4℃贮
存。
(2)分离胶贮液:30%Acr-0.8%Bis贮液:丙烯酰胺(Acr)30.0g,甲叉双丙
烯酰胺(Bis)0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100mL。
(3)分析纯过硫酸胺(AP)(AR)0.14g加重蒸水至100mL,置棕色瓶,4℃
贮存仅能用一周,最好当天配置。
以上三种试剂用于制备分离胶。
(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/L HCl 48mL,Tris 5.98g,TEMED 0.46mL,
加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,置棕色瓶,4℃贮存。
(5)浓缩胶贮液:称Acr 10g,Bis 2.5g,加重蒸水溶解后定容至100mL,过
滤后置棕色瓶,4℃贮存。
(6)40%蔗糖溶液(W/V)。
以上(3)-(6)四种溶液用于配制浓缩胶。
器材:
夹心式垂直板电泳槽,凝胶膜,直流稳压电源(电压300600V,电流50-100mA),吸管,烧杯(25,50,100mL),细
长头的滴管,微量注射器,培养皿
图
夹心垂直板电泳槽示意图
1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框
4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
操作方法:
1.安装电泳槽
2.贮液制备
3.制备凝胶板
(1)分离胶制备:
分离胶缓冲液pH8.9Tris-HCl(TEMED)2.50mL;凝胶贮液
30%Acr-0.8%Bis 5.00mL;重蒸水2.50mL ;0.14%AP 10mL
混匀后的凝胶溶液倒入玻璃板之间的窄缝内,加胶高度
距上端口2cm为止。用注射器在凝胶表面轻轻加上一层重蒸水,
用于隔绝空气,使胶面平整。约30min-60min后凝胶完全聚合,
则可看到水与凝固的胶面的界线。倒去上层的重蒸水。
(2)浓缩胶的制备:浓缩胶为pH6.7 2.5%PAA,其配制方法如下:
浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl(TEMED)1mL;浓缩胶贮
液10%Acr-2.5%Bis 2mL;40%蔗糖 4mL;0.14%AP 3mL
混合均匀后加到分离胶上方,距短玻璃板上缘0.5cm处。
轻轻插入样品槽模板。约2-3小时后凝胶完全聚合,轻轻取出
样品槽模板,用滤纸吸去多余的液体,加入稀释10倍的pH8.3
的电极缓冲液,使液面没过短玻璃板0.5cm,即可加样。
4.样品制备:
• 取材:鲫鱼若干条,解剖取1.肠、2.眼睛、3.卵、4.肉、
5.胆、6.胰、7.鳃、8.肝、9.心脏 放入冰箱保存。
• 提取酶:取不同组织块,加入提取缓冲液tris-Hcl(pH=7.0)
此溶液需4℃预冷,组织重量(g)与缓冲液体积(mL)之
比为1:5。用玻璃匀浆机冰浴中匀浆。匀浆液4℃离心约
30分钟,15000转/分钟。
• 取上清液用150ul离心管分装,加100ul 甘油和10
ul溴芬蓝混匀即可点样。
5.加样:
作为分析用的PAGE加样量仅需几微克。用微量注射器取
20 -30μL样品,通过缓冲液,小心地将样品加到凝胶凹形样品
槽底部。我们今天采用的原料是鲫鱼,有9种不同的样品(1.
肠、2.眼睛、3.卵、4.肉、5.胆、6.胰、7.鳃、8.肝、9.心脏),
各组每个同学记下样品顺序,待所有样品槽都加了样品,即
可开始电泳。
6.电泳:将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接,
打开电泳仪开关,开始时将电流调至10mA,待样品进入分离
胶时,将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框上
缘1cm时,将电流调回到零,关电源取出电泳板,轻轻将一块
玻璃板移去,在胶板一端切除一角作为标记,将胶板移至大培
养皿中染色。
7.染色:将配好的同工酶染色贮存液倒入培养皿中,染色与固定
同时进行,使染色液没过胶板,染色30min左右。
*染色液配制
NAD+(氧化型辅酶)
PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)
1M乳酸钠液(Ph7.0)
0.1M氯化钠
0.5MTris-盐酸缓冲液(pH7.1)
NBT(氯代硝基四氮唑蓝 )
临用前配置,所需体积已标在棕色瓶上?。
参考染色方法:
1、电泳结束后,取出胶条用蒸馏水漂洗后浸入染色液中置37℃温箱中保
温染色 60min.染色液配方:NAD 25mg,NBT60mg,PMS 7.5mg,20%乳酸钠
磷酸缓冲液(pH7.5)10ml, 蒸馏水30ml.
2、乳酸脱氢酶的辅酶是NAD+。当乳酸脱氢酶催化乳酸脱氢时,NAD+即
被还原为NADH。当有吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)和氯化硝基四氮唑蓝
(NBT)存在时,则发生如下反应:
NADH+H++PMS------ NAD++ PMS·H2
PMS·H2+NBT------PMS+ NBT·H2
NBT·H2为蓝紫色化合物。
基本染色液:称取NBT30mg,50mgNAD+ ,2mgPMS,15ml 0.5M pH7.5
PBS,1M 乳酸钠溶液10ml,5ml 0.1M NaCl,定容到100ml。
3、按下列比例配置反应染色液 0.2%NBT:0.2%PMS:0.01mol/l NAD:70~
80%乳酸钠:0.05mol/l磷酸钠缓冲液PH7.0=8:1:5:10:26。在37℃黑暗条件下
保温20~30分钟,酶带被染成蓝色。
4、用NAD 66mg,NBT 35mg,PMS 2mg,1mol/l乳酸钠溶液10ml,0.1mol/l
Tris-HCl PH7.0缓冲液50ml,蒸馏水40ml。在37℃黑暗条件下保温2小时,酶
带被染成蓝色。
8.拍照
9.结果处理
各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm),按
下式计算相对迁移率mR:
蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)
溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
思考题:
• 根据实验过程的体会,总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶
•
•
垂直板电泳?哪些是关键步骤?
为什么要在样品中加入少许溴酚蓝的40%蔗糖溶液?
蔗糖和溴酚蓝有何用途?
从遗传学角度思考为什么同一基因在不同组织会出现
同工酶?
实验四:遗传平衡定律
1、实验目的:
• 进一步理解Hardy-Weinberg定律
• 调查周围人群中ABO血型系统的基因频率和
基因型频率的情况
2、实验原理:
在一个大的随机交配的群体中,在无突变、
无任何形式的选择、无迁入迁出、无遗传漂
变的情况下,群体中的基因频率和基因型频
率可以世代相传不发生变化,而且基因型频
率是由基因频率决定的。
3、实验方法和步骤:
对周围人群的ABO血型的不同表现型进行
统计,进而估算出基因频率。
表 不同血型的表现型人数统计
A
个体数目
所占比例
B
AB
O
设p = IA的频率, q = IB的频率, r = i的频率
当群体处于平衡状态时,p + q + r = 1
P2 + q2 + r2 + 2pq + 2pr + 2qr = 1
又设A,B,AB,O为各血型的表现型频率
则: A = P2 + 2pr
B = q2 + 2qr
AB = 2pq
O = r2
根据遗传平衡公式计算出各基因频率,并检验此群体是
否处于平衡状态。
4、思考题:
实验中的数据是否满足遗传平衡公式?为
什么?

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