Coloraciones - parasitounsl

Report
Dr. Martín Fernández Baldo
Laboratorio de Parasitología y Micología
Área de Análisis Clínicos
Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS
• COLORANTES NATURALES (azafrán)
• COLORANTES ARTIFICIALES
Básicos : tiñen estructuras ácidas
AZUL DE METILENO
Ácidos: tiñen estructuras básicas
EOSINA
Neutros: el ácido y la base son componentes
activos EOSINATO AZUL DE
METILENO
Según tiñan de manera difusa o
selectiva:
Difusas (no en microscopía)
Específicas: colorea solo un elemento o un grupo de
elementos de un tejido.
directas (simple inmersión del colorante)
indirectas (no puede obrar directamente)
sustancias oxidantes mordientes
mordiente + colorante = LACA
De acuerdo a la manera de realizar la coloración:
 Progresivas (aumentan la intensidad de la coloración a medida
que aumenta el tiempo de exposición al colorante)
 Regresivas (sobrecolorean el preparado, decolorándolo para
conseguir contraste adecuado).
Según utilicen uno o varios colorantes:
 Simples (un solo colorante)
 Combinadas (varios)
En coloraciones simples según tomen o no el mismo
color del colorante pueden ser:
 Normocromáticas (mismo color)
 Metacromáticas (viran hacia un tono distinto). Granulaciones de
leucocitos
 COLORACIONES PANÓPTICAS (poner en evidencia el
mayor número de elementos con mayor variedad de tonos)
colorantes neutros o anfocromos - metacromasia
 COLORACIONES VITALES
colorantes vitales no tóxicos muy diluidos LUGOL, EOSINA, AZUL DE
METILENO (ideal para protozoarios).
Operación destinada a matar la célula, conservándola
tanto como sea posible, en el mismo estado en que
se encontraba.
 FÍSICOS
Calor
 QUÍMICOS
Acetona, etanol, APV
 FÍSICO-QUÍMICOS
Calor + etanol
 Muestras de sangre
 Gota Gruesa
 Extendidos de sangre
 Coloración de May–Grünwald-Giemsa
 Giemsa
 Coloración Vital: Lugol
 Observación Microscópica
1-2min
Colorear con Giemsa
diluido (1/20) 30
minutos. (hemólisiscoloración)
Lavar y secar
Dejar secar
Colocar 1 a 3 gotas
Desfibrinar
objetivo de 100x
aceite
Tripanosoma cruzi
Sensibilidad 50%
Empleo dos soluciones colorantes:
La solución de May-Grünwald, que contiene el colorante ániónico eosina y el
colorante catiónico azul de metileno ambos disueltos en metanol.
La solución de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de
productos de la oxidación de este último tales como el azur A, el azur B,
el violeta de metilo y el azul de metilo.
Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se
mantienen en metanol, pero al añadir agua se ionizan y se unen selectivamente
a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles.
Los componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen
selectivamente a los tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul.
Estos
componentes
son
llamados
basófilos:
(ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas en ARN).
Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen
selectivamente al tinte ácido eosina, tiñendose en variados tonos de naranja y
rojo. A estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el
caso de la hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de
los granulocitos eosinófilos.
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Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes se
denominan neutrófilos y se tiñen en variados tonos de violeta.
Resultado:
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Los núcleos aparecen en colores que van del color azul al púrpura-negro.
Los citoplasmas de las células maduras aparecen de un color violeta muy pálido o
marrón muy pálido.
Los glóbulos rojos, ricos en hemoglobina aparecen de colores entre rosados y beige.
Los gránulos de los neutrófilos aparecen de colores entre violeta y marrón.
Los gránulos de los eosinófilos aparecen de color naranja.
Los gránulos de los basófilos de color entre azul y negro.
Los gránulos de los linfocitos grandes aparecen de color púrpura.
Las células con gran producción de ARN (como linfocitos productores de
inmunoglobulinas y células inmaduras) presentan un citoplasma de color azul intenso.
Parásitos: citoplasma azul-celeste y sustancias cromáticas color violeta.
Fijación
El primer paso es fijar las células sanguíneas presentes en el frotis. La fijación es un
proceso fisicoquímico que altera las propiedades químicas de las proteínas que
forman las células, para que luego resistan el proceso de teñido preservando la
estructura que tenían cuando estaban vivas. La fijación la hace el metanol de la
solución de May-Grünwald (colorante neutro disuelto en metanol: carece de
propiedades tintoriales). Para fijar se colocan los frotis horizontalmente en
una parrilla y se vierten 20 gotas de solución sobre cada uno hasta que los
frotis queden completamente cubiertos. Se mantienen así durante 3 minutos
para que el metanol fije las células.
Tinción con May-Grünwald
Simultáneamente al proceso de fijación, tanto el azul de metileno como la eosina
habrán llegado a todos los compartimientos celulares, pero los colorantes no se
podrán unir a sus respectivas estructuras afines hasta que la solución se convierta en
polar, esto se consigue agregando lentamente agua (de la canilla, igual
volumen sin volcar el colorante), permitiendo así que los colorantes precipiten
selectivamente. Dejar 1 minuto.
Lavado y rehidratación - Tinción con Giemsa
La solución de Giemsa (se prepara en el momento) es mucho más polar que la
solución de May-Grünwald. Volcar y sin lavar recubrir con solución de Giemsa (1
gota de colorante por cada ml de agua). 15-30 minutos. Se lavan los portaobjetos con
agua y se dejan escurrir en posición vertical hasta que estén completamente secos.
Observación
Se hace en microscopio óptico de gran aumento con objetivo de inmersión en aceite,
esto permite ver detalles de la cromatina de los núcleos y dilucidar correctamente las
estructuras observadas.

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