3-Fundamentos de PCR

Report
Fundamentos de PCR
Dr. José A. Cardé-Serrano
Dr. Jesús Lee-Borges
Dra. Liza Jiménez
Dr. José M. Planas
Biol 4207 – Lab de Virologia y Biotecnologia
Universidad de Puerto Rico - Aguadilla
Objetivos




Estudiar los pasos que componen la
reacción de PCR
Discutir factores importantes en la
optimización de esta técnica
Conocer Aplicaciones
Preparar una reacción de PCR e incubarla
en el termociclador.
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR
PCR es básicamente una técnica de amplificación del ADN.
ADN
(molécula sencilla)
PCR
amplificación
Muchas
moléculas
PCR
Dolan Learning Center
Biology Animation Library
CSHL
Historia


1985 – se crea la
técnica molecular
conocida como
“PCR”
Kary B. Mullis,
Coorporacion
CETUS

Premio Nobel en
Química 1993
Procedimiento del “PCR”



Desnaturalización
Hibridización
Extensión
Desnaturalización



Calor del ADN
94°C.
Filamentos dobles
se derriten.
Hay una separación
física de las dos
cadenas.
Hibridización


La temperatura se reduce a 54°C.
Movimiento Browniano.




El movimiento que lleva a cabo una
partícula muy pequeña que esta inmersa
en un fluido
Enlaces de hidrógeno.
Filamento de ADN.
Bases construidas.
Extensión o Polimerización





Temperatura de polimerasas 72°C.
Los “primers” tienen una fuerte
atracción al molde o templado
Los “primers” sin exacto pareo se
pierden.
No dan extensiones de fragmento.
El procedimiento se repite y se forman
copias del ADN.
LINK
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa
5’


3’
-T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *
Cortos primers de ADN específicos hibridizan con la
cadena que tiene que ser copiada
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa
5’


3’
-T A C G T
-A T G C A T G C A T G C *
*
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa
5’


3’
-T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C *
*
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa
5’


3’
-T A C G T A C
-A T G C A T G C A T G C * *
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa
5’


3’
-T A C G T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa
5’
3’

-T A C G T A C G T

-A T G C A T G C A T G C * *
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa
5’


-T A C G T A C G T A
3’
-A T G C A T G C A T G C *
*
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de ADN a alta
temperatura (~100°C)
Reacción en cadena de la
polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Fusión
95°C
Hibridización
50-60ºC
Extensión de
La cadena
75ºC
2do Ciclo
95ºC
50 - 60ºC
75ºC
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Múltiples ciclos darán un incremento exponencial
en el número de copias
PCR LINK
Hay 6 componentes esenciales
en el proceso de PCR






ADN polimerasa termoestable
Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)
Desoxiribonucleótidos trifosfatados
(dNTPs)
Cationes divalentes
Buffer (para mantener el pH)
ADN molde (Templado)
ADN polimerasas
termoestables






Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del
templado.
Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C
Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta
Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
Cantidad usada = 5 x 1012 moléculas (1.5 unidades)
La mas comúnmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu
Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis
Oligonucleótidos iniciadores
(primers)





Se conoce su secuencia
Es el factor mas importante para la
eficiencia y la especificidad del proceso
Deben estar presentes en exceso (1013 = 30
ciclos, 1 kb)
Requieren de un cuidadoso diseño
Reglas de diseño:
(a) longitud = 18-25 bases
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
Evitar las secuencias
repetidas
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNTATA-3’
3’-ATATNNNNNNNN-5’
3´ repetido
5´
3´
3´
5´
5´
3´
PCR
3´
5´
Dímero de primer
Evitar las secuencias
repetidas
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNN-3´
3´-NNNNNNNNATAT-5´
5´ repetido
5´
3´
3´
5´
PCR
5´
3´
3´
5´
no hay extensión
Evitar las secuencias
repetidas
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
5’-NNNNNNNNNNNGCA
3’-CGT
Formación de horquillas
PCR
5´
3´
3´
5´
5´
3´
Productos de PCR no deseados
ADN molde (templado)




Puede ser ssADN o dsADN (simple o doble
cadena)
ADN circular y cerrado es levemente menos
efectivo que el ADN lineal
Usualmente se utilizan varios miles de copias,
ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de
bacteriano o 1 pg de plasmídico
Se puede amplificar a partir de una sola
molécula de ADN molde, pero las condiciones
deben estar muy optimizadas
El ciclo de PCR


Desnaturalización - 94-95°C por 45
segundos si G+C < 55%
Temperatura de hibridización (Annealing) –
debe ser calculada o determinada
empíricamente para cada par de primers



demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no específico =
productos incorrectos
Extensión - a la temperatura óptima de la
ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq
Variantes de la PCR








Touchdown PCR
Colony PCR
Multiplex PCR
Hot start PCR
Nested PCR
Inverse PCR
Long PCR
Quantitative “real time” PCR
Multiplex PCR




Describe una PCR en la cual hay presentes
múltiples pares de primers (hasta 8) lo que
da una serie de productos. Los mismos
pueden verse como múltiples bandas en un
gel de agarosa
Multiplex PCR es frecuentemente usada en
diagnóstico médico
Ahorra templado, tiempo y gastos
Requiere una cuidadosa optimización
Nested PCR




A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a
partir de un templado complejo, apareciendo un
“esparcido”
Se puede resolver utilizando un segundo par de
primers que hibriden un poco mas internamente que
los primeros
Realizar una segunda ronda de PCR usando el
producto de la primera (esparcido)
Rinde un producto único porque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de
hibridización para el segundo par de primers
Nested PCR
1era PCR
Esparcido de ADN
2da PCR
ADN específico
Clonado con PCR: clonado T-A
A-3’
T-3'
3’-A
3'-T
Producto de PCR
a partir de Taq
Vector con cola-T
ligamiento
T-3'
A
3'-T
A
Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor
que ligamiento con extremos romos
Mutagénesis por PCR




Introduce cambios de secuencia dentro de
fragmentos (clonados) de ADN
El método de extensión solapada requiere 2
primers mutagénicos y otros 2
Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´
que se solapan. Ambos portan la mutación
Usa los productos en otra reacción para
producir el ADN mutado de longitud
completa
Mutagenesis con PCR- extension
solapada
Primer mutagénico directo (forward)
Primer SP6
Dos 1ras
PCRs
separadas
primer mutagénico inverso (reverse)
X
x
remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar
x
2da PCR
x
Primer T7
RT-PCR = PCR con transcriptasa
reversa







Para amplificar copias de cADN de ANR
Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas
cantidades de ANR
Frecuentemente usada para amplificar genes específicos
(como cANDs) si algo de su secuencia es conocida
Requiere primer “antisense” y un AND polimerasa
dependendinte de ANR
Puede ser usada para construir bibliotecas de cAND
Primero se hace un cAND a partir del templado de ARN
Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el
duplex de cAND por PCR
RT-PCR LINK
mANR
(sense)
AAAAAAAAAA-3’ Primer Antisense:
TTTTTTTTTT-5’ oligo(dT)o
Transcripción reversa
GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3’
TTTTTTTTTT-5’
1ra cadena cDNA
GSP (antisense)
PCR usando
GSP+GSP1
GSP1
GSP
Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1
Real Time - PCR
-Alta especificidad
-Usa primers marcados con moleculas fluorescentes
- Resultados son no solo cualitativos sino cuantitativos
-Sensitividad mucho mayor
-LINK
Parte Práctica
Amplificación de DNA de
Fago λ
Lambda ADN




Bacteriófago Lambda (λ)
Aislado de E. coli W3110 (c/857 sam7
strain)
Usado como sustrato para enzimas de
restricción
Peso molecular 31.5×106 daltons y
genoma de 48502 pares de bases
Secuencia de Lambda DNA

Sanger et al. 1982 J. Mol. Biol. 162:
729-773
Protocolo Seguir el protocolo delineado en
el “PCR AMplificatiom Kit” Cat. #R011
React
PCR Buff
dNTP Mix
Primer 1
Primer 2/3
Taq Pol
DNA Temp
dH20
Total
Vol (ul)
5
4
0.5
0.5
[ ] Fin
1x
200uM
0.2uM
0.2uM
0.25
1.25U/50ul
0.5
0.5ng/50ul
50 (39.25)
50
-
[ ] Ini
-
Sondas control

Sonda control 1


Sonda control 2


5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT3’
5’-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3’
Sonda control 3

5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’
¿Preguntas?
Preguntas



Muy poco magnesio no produce suficiente
producto de PCR y mucho produce bases
pareadas erróneas, ¿por qué?
Al escoger los “primers” es importante evitar
secuencias que sean complementarias
entre estos, ¿por qué?
¿Como cambiaria el producto del PCR si en
vez de amplificar ADN viral se amplificara
ADN bacteriano (este ADN es metilado)?
Asignación


Hacer un reporte con la secuencia de
λ y donde en ella se pegan los primers
usados.
Demostrar la complementaridad y la
secuencia comprendida en la
amplificación.

similar documents