Document 119927

Report
Aislamiento de ADN
Paula Bautista
Bacterióloga
Métodos de aislamiento de ADN

El aislamiento o extracción
de ADN es el punto crucial
en Biología Molecular.

Es el primer paso para
realizar cualquier técnica de
biología molecular.
Extracción y Purificación

Extracción: sacar los componentes desde un
compartimento celular. Involucra:




Lisis de las células que contienen a los AN
Inactivación de nucleasas
Clarificación: separación de los AN de los restos
celulares (debris).
Purificación: Separación de AN:




De proteínas solubles
De otros AN no deseados
De Lípidos, carbohidratos
De sales y otros compuestos orgánicos
El problema
Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de
AN es necesario disponer de éstos en estado puro.
Por qué purificar?
• Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los ácidos
nucléicos.
• Interferentes que inhiben los procedimientos posteriores.
•El
desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde
una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN
•Contaminantes: Proteínas, lípidos y
iones, etc.
carbohidratos, sales del medio,
Etapas básicas para Extracción y Purificación de AN
Muestra
Lisis celular
Lugar de trabajo y
material estéril,
Separación y purificación
Además de guantes
Precipitación
Cualitativo:
electroforesis
Calidad
Cuantitativo:
espectrofotometría UV
1. Métodos de lisis celular
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza
necesaria para romper el material de inicio (células o tejido)
y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de
interés (ADN o ARN).
• Métodos Físicos (Baño María, Congelación- Descongelación
Sonicación…)
• Métodos Químicos (Detergentes)
• Métodos Enzimáticos (Proteinasa K)
2. Separación y Purificación
Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros
contaminantes celulares y la obtención de un material
genético cada vez mas limpio.
• Desproteinización con fenol, que al denaturar proteínas
causa su precipitación.
• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)
• Cromatografía


De adsorción a sílica
De filtración
*** Lavados***
3. Precipitación

Permite la obtención del ácido nucleíco listo para ser
almacenado o diluido a la concentración deseada para su
utilización.
Factores que afectan el rendimiento, calidad y
pureza de los AN purificados

Cantidad de material de partida
 Número de copias de las moléculas de AN
 Cantidad de tejido

Condiciones en las que se encuentra el material de inicio
(fresco, congelado, fijado)

Contaminantes e interferentes en el material biológico

En el pasado, el proceso de extracción y purificación
de ácidos nucleícos solía ser complicado, laborioso y
limitado en términos de rendimiento.

Actualmente existen muchos métodos especializados
que pueden ser usados para extraer biomoléculas
puras.
QIAGEN


Es un técnica rápida y fácil para obtener ADN.
El ADN puede ser obtenido a partir de sangre, plasma,
suero, capa de blancos, tejido, células bucales, otros fluidos
biológicos, cultivos celulares.
QIAGEN

El buffer de lisis es ajustado para
permitir fijar el ADN a la
membrana. El ADN es absorbido
por la membrana de sílica gel
durante la centrifugación.

Las condiciones de pH en el
lisado
aseguran
que
las
proteínas y otros contaminantes
que puedan inhibir la PCR y otras
reacciones enzimáticas, no sean
retenidas en la membrana.
Adsorción de DNA a sílica
VENTAJAS

Las muestras pueden estar en citrato, heparina
o EDTA. No es necesaria una previa separación
de leucocitos.

El procedimiento de purificación se realiza
usando las columnas y esto disminuye el grado
de contaminación.

Permite obtener un ADN libre de proteínas,
nucleasas y otros contaminantes o inhibidores.

Se obtiene buena concentración de ADN
Las muestras pueden ser frescas o congeladas.

Procedimiento
Verificación Calidad ADN
Electroforesis en
Gel de Agarosa
Gracias

similar documents