8. ADN RECOMBINANTE

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DNA Recombinante
DNA Recombinante
• Técnica utilizada para facilitar el estudio
de los genes
– Aislar
– Amplificar
• Inserción del gen de interes en otra
molécula de DNA que sirve como
vector. Molécula de DNA recombinante
Historia del DNA
Recombinante
Allan Campbell (1962)
Historia del DNA Recombinante
Historia del DNA Recombinante
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Salvador Luria: Resctricción y
Modificación
Restricción: Fagos solo crecen
en un tipo especifico de bacteria.
Moficación: Si un fago tiene la
capacidad de crecer en dos
varios tipos de bacterias.
Sistema de Restricción: Arber
and otros nucleasa que
distingue entre DNA residente o
extranjero.
Meselson y Yuan caracterizan
una enzima que cliva de
manera especifica . Enzimas de
restricción porque previenen la
infeccion viral.
Adición de grupos metilo.
Historia del DNA Recombinante
• Hamilton Smith y otros. Enzimas de
restricción clivan secuencias especifícas de
DNA
• Primer uso mapeo del virus SV40
• Boyer, Cohen y Berg generan la primera
molécula recombinante entre el fago lambda
y el virus SV40
• 1974 se clona el primer gen eucariotico
(rDNA)
Como Cortar y Pegar el DNA
• Enzimas de restricción o endonucleasas
de restricción:
– Reconocen una secuencia específica, corta
de nucleótidos en hebra doble DNA
denominada sitio de restricción.
• Enzima Ligasa: Une dos piezas de DNA
mediante la formación de enlances
fosfodiester.
Enzimas de Restricción
•
Tres clases
– Tipos de secuencias que reconocen
– La naturaleza del corte que hacen en la hebra de DNA
– Estructura de la enzima
Endonucleasas Tipo II
• Actividades de endonucleasa y de metilasa
estan usualmente separadas en subunidades
diferentes
• Nomenclatura: Denominadas teniendo en
cuenta el organismo en el que fueron
aisladas usando un sistema de letras y
números. HindIII: Haemophilus influenza,
cepa d, número de enzima aislada del mismo
tipo
Endonucleasas Tipo II
Sitios de Reconocimiento de
las Endonucleasas Tipo II
• Reconocen secuencias simetricas de
DNA de 4-6pb
• Secuencias Palindromicas: secuencia
5’>3’ es la misma de la dirección 3’>5’
Sitios de Reconocimiento de
las Endonucleasas Tipo II
Terminaciones
Escalonados
Sticky
cohesivos
Romos
Blunt
Sitios de Reconocimiento de
las Endonucleasas Tipo II
Union y Clivaje del DNA por
Enzimas de Restriccion
DNA Ligasas
• Catalizan la formación de un enlace fosfodiester entre el fosfato
5’ de un nucleotido de un fragamento de DNA y el grupo 3’
hidroxilo de otro fragmento
• Requieren ATP como cofactor
• Ligasa mas usada es del fago T4
DNA Ligasas
Clonación
• Generación de fragmentos de DNA usando
enzimas de restricción
• Ligación de fragmentos de DNA a otra
molécula de DNA denominada vector
• Tranferencia de la molécula recombinante a
una célula hospedara
• Recuperación de los fragmentos de DNA
clonados
• Purificación y Analisis.
Clonación
Vectores
• Moléculas transportadoras de DNA
• Pueden replicarse de manera
independiente
• Poseen sitios de restricción que estan
presentes una sola vez en el vector
• Poseen un marcador de selección
• Faciles de recuperar de la célula
hospedera
Tipos de Vectores/Aplicaciones
Plasmidos
• DNA circulares extracro;:mosomales que
tienen un origen de replicación y que se
replican de manera autonoma dentro de las
bacterias
• pBR322: p:plasmido, BR: Bolivar & Rodriguez,
322:número de identificación.
• Poseen un gen de resistencia a antibioticos
• Poseen un polylinker con multiples sitios de
restricción
Plasmidos
Plasmidos
• Transformación: Introducir el DNA
– Como evitar la degradación del DNA foreaneo? E.
coli DH5 bacterias deficientes en restricción y
modificación
• Selección de Recombinantes:
Bacteriofago Lambda 
• Utilizados para preparar librerias genómicas porque pueden
albergar piezas largas de DNA
Cromosomas Artifciales
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BACs: Bacterial artificial chromosomes
YACs: Yeast artificial chromosomes
MACs: Mammalian artificial chromosomes
Importantes para mapeo y análisis
complejos de genomas
Pueden incorporar hasta 300kb de DNA
foraneo
YACs y MACs tienen autonomia replicativa y
de segregación en células de mamifero
Sistemas regulatorios
Pocas copias
YACs

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