Diapositiva 1

Report
PCR PV92
Secuencias Alu
Genes divididos en eucariotas
• Gen codifica la proteína
• Esta secuencia no es corrida de principio a fin
• La secuencia de ADN en genes eucariotas
presenta interrupciones
• Interrupciones: Intrones
• Regiones codificantes: Exones
“ Splicing“
• El transcrito primario es procesado por splicing
• Elimina los intrones y une los exones
ARNm
• Ejempo: Gen de la distrofina tiene 74 intrones
ADN repetitivo
• Secuencias repetitivas encontradas en todo el
genoma
• Parte del “ADN chatarra”
• Pueden variar en longitud:
▫ LINEs: miles de pb
▫ SINEs: 200-300pb
SINEs (short interspersed nuclear elements)
• SINE tienen menos de 500pb
• En un genoma humano se pueden encontrar 500
000 o más.
• Los SINEs humanos mejor caracterizados: familia
Alu (el nombre se debe a la presencia de sitios de
restricción para la endonucleasa AluI).
• Miembros de familia Alu tienen entre 200 y 300pb
de longitud y se encuentran dispersos bastante
uniformemente por todo el genoma, tanto entre
genes como dentro de ellos.
• En humanos, secuencias Alu son más 5% del
genoma completo.
BRCA1
Rojo: exones
Flechas: Alu (más del
40% de los intrones)
Flechas azules: Alu
involucrados en
deleciones y
duplicaciones
(recombinación con
otros Alu)
Screening
para secuencia
Alu endelocus
• 2 alelos posibles:
con o sin inserción
Alu PV92
• Lo detectamos por PCR
Herencia mendeliana del polimorfismo
de Alu
Electroforesis
• Banda más pesada
puede ser más tenue
• Cuidado para no hacer
errores en asignar
genotipo
• En heterocigotas se
puede formar
heteroduplex que migra
más lento
Dímeros de primer en PCR
Primer dimers
Primer dimer
•Complejos de los dos primers
•Más frecuentes cuando reacción no amplificó,
también cuando se usa un exceso de primers
•Cuidado cuando se corren geles poco tiempo
Importancia de intrones en estudios de
variación genética
• Proporción importante de la variación genética
en los intrones o regiones entre genes. ¿Por qué?
• Importantes en: identificación de individuos y
genética de poblaciones
Resolución de problemas de PCR
http://bitesizebio.com/articles/the-essential-pcrtroubleshooting-checklist/
Ejercicio
• Primers para locus PV92:
• Hacer PCR in silico
Ejercicio
• Copiar secuencia amplificada
• Hacer un BLAST:
▫ Nucleotide BLAST
▫ Contra base de datos nr/nt
▫ Somewhat similar sequences (blastn)
• Identificar secuencias similares, ver valores de E
Ejercicio
• Analizar secuencias:
▫ Human Alu repeat
 ¿Qué observa flanqueando la secuencia Alu?
 ¿Cómo termina la secuencia Alu?
▫ Homo sapiens isolate BAS101 AluPV92 repeat
sequence
 ¿Cuál es la relación entre esta secuencia y la
anterior?
Leer artículos de Alu y diversidad genómica, inserción

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