e post-harvest - stayfresh

Report
Strategie di difesa con agenti di
biocontrollo in pre- e post-harvest …
… contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp.
Moruzzi Serena, Martini Marta
Università degli Studi di Udine, DISA
Presentazione del problema
2000:
prime segnalazioni in FVG di alterazioni della buccia delle mele
in campo e in ambiente di conservazione
Diagnosi di routine
Osservazione dei sintomi
Presenza di fumaggine
Indagini fitopatologiche
(stereomicroscopio e isolamento)
Presenza di agenti fungini
Presentazione del problema
2008:
 Università di Udine, DISA (p.a. Borselli S., prof. Osler R., dott. Grisan S.,
dott. Poggetti L.)
 Agenzia Regionale per lo Sviluppo Rurale (dott. Benvenuto L., dott.
Malossini G., dott. Frausin C.)
 FriulFruct (dott. Zampa C.)
hanno iniziato progetto di ricerca sulla malattia:
1. Ricerca bibliografica
2. Sintomatologia e diffusione della malattia: campo e ambiente di
conservazione
3. Eziologia della malattia (identificazione agente/i patogeno/i): isolamento
microrganismi e loro identificazione, postulati di Koch
4. Individuazione strategia di lotta/controllo: chimico
biologico
1. Ricerca bibliografica
- Problematiche simili (malattie epifitiche) risultavano comuni nelle zone
temperate e umide: diffuse in gran parte degli Stati Uniti, Europa (Olanda,
Norvegia, Germania, Slovenia, Serbia, Polonia), Turchia, Giappone, Cina, Brasile
- In Italia segnalazioni in Trentino Alto Adige, Piemonte, Emilia Romagna e Friuli
Venezia Giulia (Lindner, 2009; Grosso et al., 2011)
Malattia
Agenti causali
Sooty blotch (maculatura fuligginosa) - Gloeodes pomigena (Schweinitz, 1832)
- Peltaster fructicola (Johnson et al., 1997)
- Leptodontium elatius (Johnson et al., 1997)
- Geastrumia polystigmatis (Johnson et al., 1997)
- 80 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui:
Tripospermum spp. (Grabowski, 2007);
Microcyclospora spp., Stomiopeltis spp.,
Microcyclosporella spp. (Gleason et al., 2011)
Classe Dothideomycetes, ordine Capnodiales
(95%)
1. Ricerca bibliografica
Malattia
Agenti causali
Flyspeck (macchiolina di mosca)
- Schizothyrium pomi (Von Arx , 1959)
- Zygophiala jamaicensis (Mason, 1945)
- 10 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui:
Ramularia spp., Dissoconium spp. (Gleason et al.,
2011)
White haze (patina bianca)
- Tilletiopsis spp. (Boekhout et al., 2006)
2. Sintomatologia
Tipica delle malattie epifitiche (fumaggini) che si
sviluppano a spese degli strati più superficiali e
inerti del frutto:
 Striature diffuse sulla maggior parte della superficie del
frutto, concentrate soprattutto (colore nero più intenso)
nei dintorni della base del peduncolo e della depressione
calicina; frequentemente sembrano descrivere il percorso
di un percolamento, probabilmente in corrispondenza dei
punti in cui si è trovata a scorrere acqua piovana o di
condensa e quindi l’organismo si è sviluppato
maggiormente in concomitanza di tali zone, più ricche
d’acqua
2. Sintomatologia
 Iniziale opacizzazione degli strati superficiali, che evolve in un annerimento
consistente, causato dalla maturazione e sporulazione del micelio fungino
 Odore organico caratteristico
 Nessuna lesione o distruzione dei tessuti (no rugginosità)
 Interferenza sul normale sviluppo dei frutti (caratteristiche organolettiche)
 I sintomi si evidenziano soprattutto su Golden Delicious, ma risultano
sintomatiche anche altre cultivar (Golden Lasa, Gold Rush, Brina,
Summerfree)
2. Sintomatologia
In genere si riscontra in cella di conservazione:
 Durante la conservazione in cella frigo, sia in atmosfera controllata
(ULO) che non, in condizioni di elevata umidità relativa, i sintomi si
manifestano in maniera evidente
 Le mele sintomatiche nei bins sono disposte in ordine sparso e non
come tipicamente avviene per le malattie da conservazione (infezione
che inizia in campo)
 A volte (sulla base dell’andamento stagionale) è possibile riscontrare i
sintomi iniziali già in campo, nel periodo estivo
Mela sintomatica in campo
Bins con mele sintomatiche
Mela sintomatica in conservazione
2. Sintomatologia
Si è potuto osservare
una maggiore
diffusione della
malattia:
 nelle annate con
lunghi periodi
piovosi in
primavera, seguiti
da estati calde
 in caso di presenza
di fitta copertura
fogliare
 sui frutti
sviluppatisi nella
parte bassa della
pianta
2. Sintomatologia
DOVE
CAMPO
CELLA FRIGO
CELLA
ATMOSFERA
CONTROLLATA
(ULO)
COME
POCHI SINTOMI
EVIDENTI
AUMENTO
PROGRESSIVO
SINTOMI SIA COME
GRAVITÀ SIA COME
INCIDENZA
AUMENTO
PROGRESSIVO
SINTOMI SIA COME
GRAVITÀ SIA COME
INCIDENZA
QUANDO
DA LUGLIO ALLA
RACCOLTA
DALLA RACCOLTA
FINO ALLA VENDITA
DALLA RACCOLTA
FINO ALLA VENDITA
2. Diffusione della malattia
Valutazione dei sintomi presenti su mele in campo
e in cella di conservazione al fine di stabilire:
 l’influenza della tipologia di conservazione (cella frigo o
atmosfera controllata, ULO) sulla manifestazione dei sintomi
 l’influenza dei trattamenti effettuati sulla manifestazione dei
sintomi
 l’influenza del regime di coltivazione (biologico o integrato) sulla
manifestazione dei sintomi
2. Diffusione della malattia
Individuazione aziende e tesi sperimentali
Regime
Trattamenti
tesi trattata fino a termine
consentito
Conservazione
Cella frigo
Atmosfera controllata
Azienda 1
Integrato
tesi non trattata a partire
da ingrossamento frutti
Azienda 2
Cella frigo
Atmosfera controllata
tesi trattata in regime
convenzionale da inizio
ingrossamento frutti
Cella frigo
tesi non trattata fino alla
raccolta
Cella frigo
Biologico
Atmosfera controllata
Atmosfera controllata
Valutate e catalogate 2101 mele
2. Diffusione della malattia
% di superficie colpita dalla malattia in funzione della modalità di
conservazione
Azienda 1
Integrato
Azienda 2
Integrato
Azienda 2
Bio
Atmosfera Controllata (ULO)
16%
21%
37%
Cella Frigo
20%
17%
33%
Significatività
n.s
n.s
n.s
Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00
L’ incidenza della malattia non è risultata correlata con la tipologia di
conservazione
2. Diffusione della malattia
% di superficie colpita dalla malattia in funzione dei
trattamenti e del regime di coltivazione
Azienda 1
integrato
Azienda 2
Integrato
Azienda 2
Bio
Trattato
14%
10%
31%
Non Trattato
23%
30%
38%
Significatività
S p <0,001
S p <0,001
S p <0,001
Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00
L’ incidenza della malattia è risultata maggiore:
- nelle tesi non trattate rispetto a quelle trattate
- nelle tesi biologiche rispetto a quelle integrate
2. Diffusione della malattia
Conclusioni:
 L’incidenza della malattia non è risultata correlata alla tipologia
di conservazione (cella frigo o ULO)
 L’incidenza della malattia è risultata inferiore nelle tesi
trattate, rispetto a quelle in cui i trattamenti sono stati sospesi
in primavera o che non sono state sottoposte a trattamenti
 L’incidenza della malattia è risultata superiore nelle tesi
biologiche, rispetto a quelle sottoposte a regime integrato
3. Eziologia
IDENTIFICAZIONE DEL
MICRORGANISMO AL
MICROSCOPIO
OTTICO
OSSERVAZIONE DEI
SINTOMI TIPICI E
REISOLAMENTO DA
MELE INOCULATE
ARTIFICIALMENTE
IDENTIFICAZIONE
SINTOMI DELLA
MALATTIA IN CAMPO
Applicazione
dei POSTULATI
DI KOCH
INOCULO
PATOGENO SU
MELE SANE IN
LABORATORIO
ISOLAMENTO E
IDENTIFICAZIONE
DELL’ AGENTE
PATOGENO
3. Eziologia
Isolamento da mele sintomatiche da
campo e da cella frigo, su diversi substrati (Potato Dextrose
Agar, Potato Carrot Agar, Agar buccia di mela) e diverse
metodiche (da porzione di buccia infetta, da raschiatura, da
acqua di lavaggio di buccia infetta; incubazione a T° ambiente o T°
controllata a 25°C) per isolare tutta la flora microbica
presente
Sviluppo di un unico microrganismo ricorrente
3. Eziologia
Dictiospore di
Alternaria al
microscopio
ottico
Identificazione dell’agente causale al microscopio ottico,
confermata da riconoscimento presso Istituto di Micologia Olandese (CBS):
gruppo Alternaria alternata
3. Eziologia
Verifica dei postulati di Koch:
Inoculo artificiale in
laboratorio su mela sana
(immersione intere mele in
soluzione di spore di Alternaria
2*105 spore/ml, conservazione in
cella frigo o a T° ambiente fino a
comparsa dei sintomi)
Reisolamento su piastra da
sintomatologia indotta
3. Eziologia
Conclusioni:
 l’agente causale della malattia è risultato appartenere al genere Alternaria spp.
 l’applicazione dei Postulati di Koch ha confermato un solo microrganismo
fungino quale agente della malattia, sia in campo che nelle celle di conservazione
4. Strategia di controllo chimico:
agricoltura convenzionale
Capacità inibitoria dei principali fungicidi usati in melicoltura:
•Cyprodinil (Chorus)
•Difenconazolo (Score)
•Fluazinam (Ohayo)
•Zolfo puro (Thiopron)
•Pyraclostrobin (Bellis)
•Boscalid (Cantus)
•Dodina (Syllit)
•Penconazolo (Topas)
•Pyrimethanil (Scala)
•Metiram (Polyram)
•Iprodione (Rovral)
•Captano (Make-up)
2 prove parallele:
Inibizione della crescita del
micelio di Alternaria
Inibizione della capacità
germinativa delle spore di
Alternaria
4. Strategia di controllo chimico:
agricoltura convenzionale
Inibizione della crescita del micelio di Alternaria:
4 principi attivi sono risultati efficaci:
- Difenconazolo (Score)
- Iprodione (Rovral)
- Penconazolo (Topas)
- Cyprodinil (Chorus)
4. Strategia di controllo chimico:
agricoltura convenzionale
Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria
4. Strategia di controllo chimico:
agricoltura convenzionale
Riduzione
germinazione
spore di
Alternaria
Riduzione crescita
micelio di
Alternaria
Pyrimethanil (Scala)
si
no
Metiram (Polyram)
si
no
Captano (Make-up)
si
no
Penconazolo (Topas)
si
si
Cyprodinil (Chorus)
si
si
Difenconazolo (Score)
no
si
Iprodione (Rovral)
no
si
Agrofarmaco
Principio attivo
Inoculo
patogeno
2% di spore di Alternaria germinate
Penconazolo
(Topas)
Inoculo
patogeno
Testimone
Testimone
Principio attivo
Inoculo
patogeno
15% di spore di Alternaria germinate
Cyprodinil
(Chorus)
Inoculo
patogeno
Testimone
Testimone
4. Strategia di controllo chimico:
agricoltura biologica
Rame ossicloruro
Colonia a 4 giorni di crescita su PCA
12 volte la dose
consigliata in
etichetta
(40 gr/lt)
29 volte la dose
consigliata in
etichetta
(100 gr/lt)
17 volte la dose
consigliata in
etichetta
(60 gr/lt)
23 volte la dose
consigliata in
etichetta
(80 gr/lt)
4. Strategia di controllo chimico:
agricoltura convenzionale e biologica
Conclusioni:
 Sono stati individuati alcuni principi attivi in grado di controllare la
crescita del micelio e la germinazione delle spore di Alternaria spp., in
particolare il Penconazolo e il Cyprodinil sono risultati i più efficaci
 Il rame ossicloruro, utilizzato nei regimi di agricoltura biologica, non
dotato di selettività ed efficace nei confronti di gran parte degli organismi
microfungini, non si è dimostrato efficace nei confronti di Alternaria spp.
Progetto Ager StayFresh
Inizio progetto: 2011
Il progetto di ricerca AGER STAYFRESH “Strategie innovative
rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli
della IV gamma”, si è occupato anche della ricerca di trattamenti
fitoiatrici sostenibili, basati sull’utilizzo di antagonisti naturali contro i
patogeni vegetali.
Attività previste (Task/activities):
1.2.4. Ricerca di antagonisti naturali contro malattie di
post-raccolta su mela
1.2.5. Applicazione di antagonisti naturali e
monitoraggio su mela
(+) Caratterizzazione dell’agente causale della malattia
Caratterizzazione dell’agente causale
Valutazione della possibile variabilità genetica (caratterizzazione
molecolare) del patogeno, a causa della difficoltà del
riconoscimento morfologico delle specie di Alternaria «smallspored» (Polizzotto et al., 2012):
Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da
mele sintomatiche:
Estrazione del DNA da micelio fungino
Amplificazione della regione ITS (Internal
Transcribed Spacer) con tecniche di PCR-RFLP
Confronto con i profili di restrizione dei ceppi
di riferimento di A. alternata, A. arborescens e
A. tenuissima
Caratterizzazione dell’agente causale
Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp.
isolati da mele sintomatiche:
 Amplificazione della regione
IGS (Intergenic Spacer) con
tecniche PCR-RFLP
 Confronto con i profili di
restrizione dei ceppi di
riferimento di A. alternata,
A. arborescens e
A. tenuissima
Caratterizzazione dell’agente causale
Caratterizzazione morfologica su 41 ceppi di Alternaria
spp. isolati da mele sintomatiche:
 osservazione delle colonie su terreni Potato Carrot Agar e DRYES
A. arborescens
A. alternata
Tot: 17 ceppi A. arborescens, 24 ceppi A. alternata
Caratterizzazione dell’agente causale
Ripetizione prova di patogenicità:
inoculo patogeno su mela sana
 mele sterilizzate in superficie con
esposizione a raggi UV-C (UNIUD-DIAL, 10’ per
lato, λ 254 nm)
 individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3
diverse posizioni (calice, peduncolo,
equatore) e inoculati con una soluzione di
spore (2*105 spore/ml) di Alternaria
arborescens (3 ceppi diversi) e Alternaria
alternata (3 ceppi diversi)
 valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici
della malattia (fumaggine nerastra) a T
ambiente e a 0°C
Caratterizzazione dell’agente causale
Spot sintomatici alla fine della prova
(30 dpi a T° amb, 80 dpi a 0°C)
Percentuale di spot con sintomi
100%
90%
Mele infettate con
A. arborescens 0°C
80%
70%
Mele infettate con
A. arborescens T° amb
60%
Mele infettate con
A. alternata 0°C
50%
40%
Mele infettate con
A. alternata T° amb
30%
20%
10%
0%
Spot sintomatico, a occhio nudo e allo stereomicroscopio
Caratterizzazione dell’agente causale
Conclusioni:
 Sono stati isolati diversi ceppi fungini associati alla sintomatologia
descritta e appartenenti al gruppo di Alternaria alternata
 In particolare, sono stati identificati 24 ceppi di A. alternata e
17 ceppi di A. arborescens
 Le prove di patogenicità effettuate hanno permesso di stabilire che
A. arborescens è in grado di provocare sintomi identici a quelli
osservati in campo
 A. alternata invece ha manifestato una minor virulenza, con sintomi più
lievi e assenza del caratteristico odore organico
 La valutazione dei sintomi ad occhio nudo è risultata spesso difficoltosa
(necessità di uso dello stereomicroscopio)
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Ricerca degli antagonisti:
90 isolamenti da mele asintomatiche in cella frigo
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
73 isolati tra lieviti e funghi utilizzati per prove di antagonismo
preliminari in vitro contro Alternaria spp.
Alternaria
ORGANISMI
EFFICACI
ORGANISMI NON
EFFICACI
antagonista
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
57 microrganismi sono risultati in grado di ostacolare la crescita
del patogeno
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Identificazione degli antagonisti:
 Suddivisione morfologica
 Estrazione rapida del DNA
genomico fungino
 PCR-RFLP
 Sequenziamento e confronto in
GenBank
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Identificazione degli antagonisti:
N°di colonie ottenute dagli isolamenti
30
25
Aureobasidium
20
15
Cryptosporiopsis
Epicoccum
Acremonium
10
5
0
Funghi diversi
Lieviti diversi
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Azione degli antagonisti:
Prove di antagonismo in vitro a T° ambiente
per :
Alternaria
(controllo)
Aureobasidium
Cryptosporiopsis
Acremonium
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Diametro della colonia in mm
Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti
(temperatura ambiente)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aureobasidium
Acremonium
Cryptosporiopsis
Alternaria (controllo)
7 giorni
14 giorni
21 giorni
28 giorni
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Azione degli antagonisti:
Prove di antagonismo in vitro in cella frigorifera (≈ 0°C)
per :
Alternaria
(controllo)
Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti
(0°C)
Diametro della colonia in mm
25
Aureobasidium
20
Acremonium
15
Cryptosporiopsis
10
5
Alternaria
(controllo)
0
4 sett
5 sett
6 sett
7 sett
8 sett
9 sett
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Analisi molecolari su 27 ceppi isolati di Aureobasidium spp.:
 Analisi della porzione ITS
Analisi con tecniche di rep-PCR
nessuna differenza evidenziabile
suddivisione in circa 10 gruppi
molecolari
Le sequenze ottenute dalla porzione ITS di 2 ceppi rappresentativi
hanno mostrato una similarità di sequenza del 100% con la
sequenza di A. pullulans var. pullulans strain CBS 584.75 (accession
number FJ150906) presenti in banca dati
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
 Verifica dell’azione antagonistica in vitro di ciascun gruppo nei
confronti di diversi ceppi di Alternaria spp.
(3 A. arborescens + 3 A. alternata)
B
B
A
B
A
Azione antagonista di A. pullulans (A)
nei confronti di A. arborescens (B)
A
B
A
Azione antagonista di A. pullulans (A)
nei confronti di A. alternata (B)
A. pullulans è risultato svolgere una valida azione antagonista nei confronti di A.
arborescens, mentre non è risultato molto efficace nei confronti di A. alternata
 Scelta di 4 ceppi rappresentativi di A. pullulans da usare nelle prove di
antagonismo in vivo su mele frigoconservate: 1-4-6-10
Ricerca di potenziali microrganismi
antagonisti
Conclusioni:
 Sono stati isolati diversi organismi con azione antagonistica nei confronti di
Alternaria spp.
 Gli organismi rivelatisi maggiormente efficaci (appartenenti a 3 diversi
generi) sono stati utilizzati per prove di antagonismo a temperatura
ambiente e a circa 0°C (t delle celle di conservazione) e hanno mostrato di
ostacolare in maniera significativa la crescita del patogeno in entrambe le
condizioni di temperatura
 Gli organismi isolati appartenevano principalmente (27 su 57) alla specie
Aureobasidium pullulans, appartenenti a 10 gruppi molecolari
 L’azione antagonistica è risultata più efficace nei confronti di A. arborescens
che nei confronti di A. alternata
 4 ceppi di A. pullulans più efficaci in vitro sono stati scelti per prove in vivo
Applicazione di potenziali
microrganismi antagonisti
in pre-harvest







Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens:
individuazione a Maggio di un meleto da condurre senza trattamenti fungicidi
preparazione di una soluzione di cellule di Aureobasidium pullulans ceppi 1-46-10 ad una concentrazione finale di 2* 108 CFU/ml
10 piante trattate ciascuna con 500 ml della soluzione ottenuta, distribuita con
atomizzatore sull’intera chioma
4 trattamenti durante la stagione: 28.06.13; 27.08.13; 03.09.13; 16.09.13
raccolta mele da 10 piante trattate (circa 1000 frutti) e da 10 non trattate (circa 800
frutti) (controllo negativo) il 26.09.13
individuati 6 spot per ciascuna mela in 3 diverse posizioni con le stesse
modalità utilizzate per la prova di patogenicità, inoculati con una soluzione di
spore di Alternaria arborescens (2*105 spore/ml)
valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra)
in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con
bassa umidità relativa a T° ambiente e a 0°C
Applicazione di potenziali
microrganismi antagonisti
in post-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens:
 mele non trattate inoculate per immersione in una soluzione di cellule
di Aureobasidium pullulans (5*108 cfu/ml)
 individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni e con le stesse
modalità utilizzate per la prova di patogenicità, e inoculati con una
soluzione di spore di Alternaria arborescens (2*105 spore/ml)
 valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine
nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in
ambiente con elevata umidità relativa a T° ambiente e a 0°C
Applicazione di potenziali
microrganismi antagonisti
in pre- e post-harvest
Percentuale di spot con sintomi
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens a
T° ambiente
Mele non trattate
con elevata u.r.
A
A
Mele trattate in
post-harvest
Mele non trattate
con bassa u.r.
B
B
Mele trattate in
pre-harvest
Comparsa dei primi sintomi (15 dpi)
Fine prova (40 dpi)
Fisher’s exact test: P < 0.0001, estremamente significativo
Applicazione di potenziali
microrganismi antagonisti
in pre- e post-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens
in cella frigorifera
A
Percentuale di spot con sintomi
A
Mele non trattate con
elevata u.r.
Mele trattate in postharvest
B
Mele non trattate con
bassa u.r.
Mele trattate in preharvest
Comparsa dei primi sintomi (120 dpi)
Fine prova (200 dpi)
Fisher’s exact test: P < 0.0001, estremamente significativo
B
Applicazione di potenziali
microrganismi antagonisti in pre- e
post-harvest
Conclusioni:
 Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità dell’antagonista di
contenere la malattia, in pre-raccolta, con buoni risultati ma con alcune
criticità:
 si sono manifestati leggeri sintomi a carico delle foglie (piccole necrosi fogliari),
dovuti probabilmente alla eccessiva quantità di cellule di A. pullulans utilizzate
ed alla modalità di trattamento
 si sono osservati dei sintomi di fumaggine (provocata da A. pullulans e diversa
da quella causata da A. arborescens) durante la conservazione, nelle porzioni
maggiormente umide
 Sarà necessario mettere a punto i trattamenti, con una minore quantità di
spore per ottimizzare l’azione dell’antagonista, e trovando il momento
ideale per l’applicazione
Applicazione di potenziali
microrganismi antagonisti in pre- e
post-harvest
Conclusioni:
 Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità
dell’antagonista di contenere la malattia quando utilizzato in postraccolta, con ottimi risultati
 Aureobasidium pullulans si è dimostrato un organismo di
biocontrollo efficace anche nei confronti della fumaggine del melo

similar documents