Yeast-Two-Hybrid: Prinzip

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ProteinInteraktionsanalysen mittels
Yeast-Two-Hybrid Assay
Grundpraktikum Genetik
Analyse von Protein-Protein Interaktionen
•
•
In vitro Methoden:
– (Co-)Immunpräzipitation
– Affinitätschromatographie
– Cross-linking
– Protein-probing
– Phage-display
– Protein-Chip
(zwei interagierenden Proteinen im Lysat)
(potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert)
(chemische Verknüpfung von Partnern)
(markiertes Protein beweist eine Bindung)
(Suche nach Partner in einer Bibliothek)
In vivo Methoden:
– Fluorescence energy transfer (FRET)
– Hefe-Zwei-Hybrid
– Hefe-Tribrid-System
– Split-YFP
Saccharomyces cerevisiae
• 1996 Genomsequenz – 1. sequenzierter eukaryotischer Organismus
~ 12 Mb, 16 Chromosomen
~ 6000 Gene
• biotechnologische Nutzung
• Modellorganismus
 Genetik, Biochemie, Molekularbiologie
Zellbiologie
 schnelles Wachstum, leicht zu
kultivieren
 leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung
von Mutanten
 nicht pathogen
 stabiler haploider Zyklus
 transformierbar
Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor
keine Galaktose im Medium:
Galaktose im Medium:
GAL80 bindet an AD von GAL4
GAL80/GAL4 Komplex bindet an
UAS bindet an den Promtor
GAL4 bindet an Promotor
Transkription der GAL-Gene
unterdrückt
Transkription der GAL-Gene aktiviert
Yeast-Two-Hybrid: Prinzip
X = Bait =
Protein für
Identifikation
von Bindungspartner
X = Prey =
Target für Bait
z.b. Bibliothek
!!!! Verwendete Hefe-Stämme haben
ein mutiertes (defektes) Gal4 !!!!
Yeast-Two-Hybrid: Prinzip
β-Galactosidase
• ins Hefe-Genom integriert
Auxotrophie und Prototrophie
• auxotroph: bezeichnet Organismen, die
bestimmte essentielle Substanzen nicht
selbstständig synthetisieren können
• prototroph: bezeichnet Organismen, die alle
benötigten organischen Wachstumsfaktoren
(Aminosäuren, Nukleotide,…) selbst synthetisieren
können
Yeast-Two-Hybrid: Hefestämme
Klassische(genetische) Nomenklatur:
a-Zelle → a-factor,
α-Rezeptor
α-Zelle → α-factor,
a-Rezeptor
ARG 2
arg2
arg2-9
arg2-Δ
ARG2::LEU2
Arg2p
Arg+
Arg-
Wildtyp Gen
Mutiertes Gen
Spezifische Mutation in Gen
Deletionsmutante
Disruptionsmutante
Protein
Arg prototroph
Arg auxotroph
Yeast-Two-Hybrid: Plasmide
Yeast-Two-Hybrid: Transformation
• Transformation: Hitzeschock bei 42°C
• LiAC:
erhöht Permeabilität und DNA-Bindekapazität der Zellwand
• carrier DNA:
bindet an die Zellwand (einzelsträngige DNA bindet
effektiver als doppelsträngige DNA)
• PEG:
vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an
Hefezellen
Yeast-Two-Hybrid: Transformation
Wichtig:
 Unter der Cleanbench arbeiten
 Alle Lösungen und Platten nur unter der Bench öffnen
 Berechnung der Plasmidmenge (1 µg für Trafo)
Bsp.: 129 ng/µl = Miniprep
1000 ng
129 ng/µl
= 7,75 µl
 !! SD-Trp für Stamm AH109 und pGBKT7-constructs
 !! SD-Leu für Stamm Y187 und GADT7-constructs
Mating und Selecting
1
5
9
13
2 3 4
6 7 8
10 11 12
14 15 16
Testen auf Protein-Protein Interaktion
Testen auf Protein-Protein Interaktion
•
Mangelmedium
– SD-Leu-Trp-His: low stringency medium
•
Galaktosidase-Assay
– α-Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert
MEL1 UAS schwacher Promotor
– β-Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert
GAL1 UAS starker Promotor
Testen auf Protein-Protein Interaktion
•
HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation
ausgeschaltet
•
aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 → falsch Positive
•
3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol
kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes
(Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase)
!!! Selektives Medium ohne Histidin nötig !!!
Analyse von Protein-Protein Interaktionen
Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae
Anwendungen:
•
•
•
•
Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2
Interaktion zwischen Proteindomänen
Rolle einzelner Aminosäurereste für Interaktion
Identifizierung von neuen Interaktionspartnern
Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid
Vorteile
• hoch sensitiv
• in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine nötig,
postranslationale Modifizierungen)
• billig, robust
• Screening
Nachteile
• Interaktionsstelle durch AD/BD Domäne verdeckt
• kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden
• richtige Faltung, Stabilität der Proteine in der Hefezelle
• abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe
• Protein ist toxisch für Hefe
• BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive)
• zeitliche und räumliche Expression der Proteine
MADS-BOX Domain Proteine
MADS
DNAbinding
I
K
Protein-protein interaction
C
Transcriptional
activation
ABC Modell – Arabidopsis thaliana
A
ABCDE Modell – Arabidopsis thaliana
Liriodendron tulipifera (tulip tree)
•
Family: Magnoliaceae
•
Flower:
– Monoecious
– 9 tepals
•
small genom size
•
Habitat: Eastern North
America
(784 Mbp)
Amborella trichopoda
•
most basal angiosperm
•
Family: Amborellaceae
•
small, evergreen
•
unisexual flower :
– tiny, typically about 4-8
mm
– 5 – 8 tepals
– wind and insect
pollination
•
Habitat: New Caledonia
A
A: female flower
B: male flower
B
zu untersuchende Proteine
Amborella trichopoda
(AMTR)
AMTR-AGL2
AMTR-PI
AMTR-AG
E function
B function (GLO)
C function
Liriodendron tulipifera
(LITU)
LITU-DEF1
LITU-AGL2
LITU-PI
B function
E function
B function (GLO)
Evolution des ABC-Models in
Abhängigkeit von der
Speziation der Blütenpflanzen.
se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina,
ca-Carpell
ProteinInteraktionsanalysen mittels
Yeast-Two-Hybrid Assay
2. Tag
2. Tag
• Auswertung 1. Tag
• ß-Galactosidase Assay
• Kolonie-PCR
Auswertung 1. Tag
Kolonien
zählen
Wachstum?
Wachstum?
Wachstum?
Was ist auffällig, anders
als die Erwartung?
Kolonie-PCR
Zellaufschluss
mit NaOH
Primer fwd
Primer rv
PCR
Gel
PCR-Produkt
Mastermix
Mischung enthält alle Komponenten um mehrere
Reaktionen anzusetzen.
Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers!
Bsp: 5 Reaktionen
1x
5,5 x (oder 6 x)
Puffer 10 x
5 µl
27,5 µl
dNTPs 2mM
5 µl
27,5 µl
ddH2O
34 µl
187 µl
Taq
1 µl
5,5 µl
45 µl (final 50 µl)
ß-Galactosidase Assay
Indigo Farbstoff
• wird nicht sekretiert
• Zellaufschluss mit Chloroform!!
ß-Galactosidase Assay
Agarplatte
Alufolie
Chloroform
Chloroform
Abdampfen
lassen !!!
+ Agar mit X-Gal
3h – 24 h
Organisatorische Infos
!!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!!
• 3 Freiwillige zum Gele gießen
• Mittagspause nach dem X-Gal Test
• Praktikum Do und Fr
• Start pünktlich 8 Uhr
• Bitte das Skript runterladen und
LESEN!! Fragen beantworten!!!
• Klausur am Freitag 15 Uhr – 16 Uhr

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