008 - Diagnostica - Sezione di Microbiologia

Report
Esame batteriologico
Finalità:
Ricercare in modo rapido ed accurato
gli agenti responsabili di processi
infettivi
Identificarli e determinare la loro
sensibilità agli antibiotici
normale popolazione residente
opportunista
patogeno
metodi rapidi di identificazione
preliminare
Microscopici:
• esame a fresco:
vetrino + coprioggetto
vetrino a goccia pendente
• colorazioni: Gram, Blu di metilene
• inchiostro di china
Immunologici:
• reazione Anticorpo/Antigene
Biologia Molecolare
scelta dei terreni, semina
dipende dalla sede dell’infezione
e dell’atteso patogeno
responsabile
terreni di coltura
Terreni solidi in piastra:

arricchiti

selettivi

differenziali
Terreni solidi in provetta
Terreni liquidi
• I terreni possono essere
acquistati già pronti oppure la
preparazione può avvenire in
laboratorio con polveri che si
trovano in commercio
• Le istruzioni per la
preparazione sono riportate
sulla confezione o su appositi
manuali per terreni particolari
e più complessi
6
Substrati solidi (piastre Petri)
7
semina
1
2
4
3
• Terreni nutrienti
permettono la crescita
della maggior parte dei
microrganismi
• Terreni selettivi
permettono la crescita
solo di alcune specie
• Terreni differenziali
permettono la
discriminazione di una
specie dall’altra grazie
ad opportuni indicatori
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Agar Sangue
• Terreno nutriente con 5
% sangue di montone
• non permette la crescita
di Haemophilus,
Neisseria, micobatteri,
Bordetella, Francisella,
Legionella
Streptococcus pyogenes
10
emolisi
parziale, viridante
a
totale
b
12
Agar cioccolato
• Terreno nutriente e selettivo con
sangue di cavallo (il sangue è
fatto scaldare a 80°C per
permettere la rottura dei globuli
rossi e la liberazione nel terreno
di ematina e NAD)
• Permette la crescita della
maggior parte dei batteri ma in
particolare dell’ H. influenzae e
delle Neisserie.
13
14
Mc Conkey
• Selettivo per enterobatteri
• Sali biliari e cristalvioletto
inibiscono la crescita di batteri
gram positivi
• Lattosio e rosso neutro
consentono di differenziare gli
enterobatteri fermentanti (es.
E. coli) dai non fermentanti
(es. Acinetobacter)
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Enterobatteri non fermentanti
Enterobatteri fermentanti
16
Agar sale-mannitolo
• Selettivo/differenziale
• Contiene NaCl,
mannitolo, rosso fenolo
• Utilizzato per isolare
stafilococchi e
streptococchi, inibisce
la crescita della maggior
parte degli
enterobatteri.
Staphylococcus aureus
17
Agar sale-mannitolo
18
Agar Thayer Martin
• Terreno selettivo per Neisserie
patogene
•
(N. gonorrhoeae, N.
meningitidis, N. lactamica), gli
altri batteri sono per la maggior
parte inibiti.
• Contiene vancomicina (3mg/l),
colistina (7.5 mg/l), nystatina
(12.53 mg/l), trimetoprim (15.3
mg/l)
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Agar Shigella/Salmonella (XLD)
• Agar selettivo/differenziale per patogeni enterici
• Contiene xiloso, lisina, desossicolato.
Salmonella spp.
Klebsiella pneumoniae
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Sabouraud agar
• Isolamento miceti
• Aggiunta di ampicillina 0.5% e cloramfenicolo 2%
• Per la differenziazione di C. albicans dalle altre
specie si aggiunge inoltre fenolftaleinadifosfato 5%
e verde metile 0.5%
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Terreni liquidi
• Tioglicolato: agente riducente che allontanando
l’ossigeno dal terreno soddisfa le esigenze nutritive
della maggior parte dei batteri anaerobici.
• Brain heart: contiene estratti di cuore, cervello,
peptone, destrosio, NaCl. È particolarmente nutritivo
per la crescita della maggior parte dei microrganismi
inclusi streptococchi e pneumococchi.
• Triptyc soy broth: contiene triptone, soia, NaCl.
• Brodo selenite: contiene triptone, lattosio, selenite. È
utilizzato per favorire la crescita di Shigella e
Salmonella.
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Terreni
Terreni differenziali
Contengono sostanze che
rilevano le attività biochimiche
caratteristiche dei germi
(es. fermentazione, idrolisi)
(A.lattosio, cromogeni).
Alcuni terreni selettivi (MSA,
Bile) sono anche differenziali.
cromogeni
colorazioni
La colorazione in batteriologia, introdotta verso la
metà del XIX secolo, è stata in gran parte
responsabile dei grandi progressi che si sono verificati
nella microbiologia.
I coloranti derivano da tre composti organici:
C6H5-CH3
toluene
C6H5-OH
fenolo
C6H5-NH2
anilina
e sono divisi in due grandi categorie: acidi e basici, i
batteri sono basofili quindi vengono usati coloranti
basici
colorazioni
 blu di metilene
 Ziehl-Neelsen
 violetto di genziana (Gram)
 metacromatica
colorazione di GRAM
blu / violetto
gram positivi
rosso
gram negativi
gram positivi
Bastoncini (lattobacilli)
gram positivi
stafilococchi
gram positivi
streptococchi
gram negativi
bastoncini
antibiogramma
Determinazione della sensibilità
dei germi agli antibiotici
 diluizione

in provetta
diffusione in Agar (Kirby-Bauer)
(metodo standard)
Mueller-Hinton agar
• Estratto di carne, casaminoacidi,lievito
• Utilizzato per saggiare la sensibilità dei
microrganismi agli antibiotici
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Kirby Bauer
d2
d
E-test
Metagenomics
As a result, the genetic and biological
diversity of microorganisms is an
important area of scientific research.
Unfortunately, scientists are able to grow
LESS THAN 1% of all microorganisms
observable in nature under standard
laboratory conditions. This leaves
scientists unable to study more than 99%
of the biological diversity in the
environment
• VBNC: attivazione di uno stato vitale
ma non coltivabile
• Internalizzazione: b-lattamici e
aminoglicosidi non entrano all’interno
delle cellule (Ig, PMN)
• Induzione di forme filamentose
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http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
39
40
41
Rappresentazione schematica della divisione di cellule
bastoncellari o coccoidi
I batteri si dividono per scissione binaria
Il tempo di divisione (generazione) della cellula batterica è molto
variabile e dipende dalla specie e dal terreno di coltura
Ad es. E. coli può dividersi ogni 20 min, in una notte oltre
20 generazioni (circa 500 anni per un uomo)
M. tuberculosis ha un tempo di generazione di circa 24 ore
• Durante questo periodo molti
caratteri di patogenicità e
virulenza e di resistenza agli
antibiotici possono essere persi
specie se veicolati da plasmidi
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Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
L’intenso uso di antibiotici non incide
solamente sull’evoluzione delle
resistenze, ma anche sulla fisiologia
dei microrganismi
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Curva di crescita di un ceppo veicolante un plasmide
Il ceppo J53 è un E.
coli
in
grado
di
ospitare un plasmide
(es. R64) o altro simile
ma di P.M. superiore.
In
ogni
caso
la
semplice aggiunta di
altro
materiale
genetico incide sulla
velocità di crescita.
D.O.
Tempo
45
Curva di crescita
3500
3000
DOx100
2500
ATCC 25922
ATCC 25922 Rfx-R
2000
1500
1000
500
0
T0
T20
T40
T60
T80
T100 T120
Tempo (minuti)
Ceppo selvaggio e suo derivato resistente alla rifaximina
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Il ceppo resistente risulta subire gli stessi effetti del ceppo sensibile ma a concentrazione maggiore
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Enterobatteri
Costo biologico della resistenza
Fitness batterica:
concetto complesso da definire
comprende molte componenti:
Tasso di crescita (test COMPETIZIONE)
Virulenza (test in vivo, espressione fattori di
patogenicità)
48
Andersson e Levin, Curr Opin Microbiol, 1999; Andersson Curr Opin Microbiol, 2006
Enterobatteri fosfomicino-R
Costo biologico
ceppi mutanti di E. coli e K.
pneumoniae rispetto agli
isogenici:
hanno ridotta velocità di
crescita
sono più sensibili alla
fagocitosi
Modificata idrofobicità di
superficie
Li Pira, Pruzzo e Schito Eur. Urol, 1987
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Conclusions
Thus, reversibility studies at both the individual
and community level indicate that often resistant
bacteria are able to persist for a long time, even
if no antibiotic selective pressure is present.
Compensatory evolution, cost-free mutations
and co-selection of resistance markers provide
likely explanations for this poor reversibility.
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