DNA recombinante

Report
Engenharia do DNA
María Julia Barison
BMP-5777 Biologia Molecular e
Bioquimica de proteínas alvo a drogas
do parasita da malária humana
Plasmodium falciparum
USP - 2012
DNA recombinante: qualquer molécula de DNA composta de
sequencias derivadas de diferentes organismos.
Organismos geneticamente modificados (OGMs): qualquer
organismo gerado a partir da introdução de DNA recombinante.
Aplicações:
 Medicina
 Produção de hormônios como insulina ou fatores de
crescimento
 Produção de vacinas
 Pesquisa
 Produção de proteínas recombinantes
 knock-out e superexpressão de genes para estudos funcionais
 Estudos de expressão e localização subcelular (genes
repórteres)
 Melhoramento animal e vegetal (OGMs)
1. Fragmento de DNA de interes + Vetor
2. DNA recombinante
3. Replicação do DNA recombinante
em células hospedeiras
4. Isolamento, sequenciamento e
manipulação do fragmento de DNA
purificado
1. Fragmento de DNA de interes + Vetor
DNA
• PCR
• Livrarias de DNA
• Plasmídeo
 Origem de replicação (ORI)
 Marcador de seleção (resistência a ATB)
 Polylinker (sítios de corte únicos para
diferentes ER)
VETOR
• Bacteriófago Lambda/Cosmidos
• BAC (Bacterial Artificial Chromosomes)
• YAC
Molecular Cell Biology, 5ta edição
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipo
Estrutura
Cofatores
Sítio de
reconhecimento
Sítio de corte
Tipo I
Multifuncional, várias
subunidades
Mg2+, ATP,
AdoMet
Asimétrico
Aleatóriamente, a
distância médias de
1000 pb.
Tipo II
Restrição e modificação
em enzimas diferentes
Mg2+
Palindrómicos
Dentro da sequencia
de reconhecimento*.
Tipo III
Multifuncional, várias
subunidades
Mg2+, ATP,
Asimétrico
A uma distância de
25-27 pb da seq de
reconhecimento.
*Extremos produzidos pelas
enzimas tipo II:
Bickle and Krüger (1993); Molecular Cell Biology, 5ta edição
LIGASES
OUTRAS ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM
Vetores tipo T - ligação
Clonagem por recombinação
Replicação do DNA recombinante em
células hospedeiras
Transformação:
• Shock térmico
• Electroporação
4. Isolamento,
sequenciamento e
manipulação do
fragmento de DNA
purificado
Molecular Cell Biology, 5ta edição
MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA
Tipos de mutação:
• Pontual
• Deleção
• Inserção
Sem
Mutação
Mutação Pontual
Silenciosa
Nonsense
Missense
conservativa
Não -conservativa
ESTRATÉGIAS
Introdução da mutação
desejada + sítio de restrição
Introdução da mutação
desejada
Sequencia de interes
Primer que introduzirá ou
eliminará um sítio de restrição
Sítio de restrição que
permitirá o screening de
clones mutantes
Se um sitio foi eliminado,
ele pode ser utilizado
para aumentar a
proporção de clones
mutados.
Sistema pALTER
Mutagênesis sítio dirigida mediante Overlap Extension PCR
PCR
Clonagem
Desnaturação
Amplificação
Re-hibridação
Extensão
Ho, S. N et al (1989)
Screening dos clones mutados:
• Análise por digestão com enzimas de restrição
• Identificação do clone por hibridação com sonda marcada
Colonias de
bacterias levando o
plasmídeo mutado
Membrana de
nitrocelulosa
Incubação da membrana
com solução alcalina
DNAss unido à membrana
Hibridação com sonda
marcada
Sinal positivo
Adaptado de Molecular Cell Biology, 5ta edição
Obrigada pela
atenção!!...

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