中药制剂中各类化学成分分析

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第四章
中药制剂中各类化学成分分析
药物分析教研室
第一节 生物碱类成分分析
•
生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物(如氨基酸、
蛋白质和B族维生素等)之外的所有含氮有机化合物,因
其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。
•
生物碱绝大多数具有显著的生物活性,因此中药制剂中有
含有生物碱类成分的中药时,常选择该中药含有的生物碱
成分作为定性定量的依据。
一、 生物碱类成分的主要性质及分析特征
(一)结构特征
• 生物碱大多由C、H、N、O元素组成,极少数分子中尚
含有其他元素;大多结构复杂,结构类型较多.
• 结构中的氮原子有多种形式:脂氮、芳氮;季胺、叔胺、
仲胺及伯胺;游离状态和与酸结合状态;还有以氮氧配位
键形式存在的。
• 此外,结构中除烷烃、羟基取代外还有羧基、酚羟基等
酸性官能团及酯键的取代。
(二)理化性质
1、物理性状
• 多数生物碱为结晶型固体,少数为无定型粉末,还有
一些小分子生物碱为液体,例如槟榔碱、菸碱等;液体
状的生物碱及个别小分子生物碱尚有挥发性甚至升华性,
如麻黄碱具有挥发性、咖啡因具有升华性等。
• 一般生物碱为无色或白色,但结构中具有较长共轭体
系,并有助色团的,可显不同颜色。
• 生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子的具有旋
光性,并大多与生物碱的生理活性有关,通常左旋体比
右旋体生理活性强。
2. 溶解性
由于生物碱结构复杂,生物碱的溶解性也是多样化。
• 大多数生物碱成分极性较小,游离状态下难溶于水,易溶
氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂,
• 与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加,但与生物碱结合
的酸不同,生成的盐水溶性也有差异,一般含氧无机酸及
小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。
• 季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水,
• 液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于
有机溶剂。
• 含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛
性碱液。
3. 沉淀反应
• 大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不
溶于水的复盐或分子复合物,这些试剂称生物碱沉淀试
剂。
生物碱的沉淀试剂根据其组成有碘化物复盐、重金属
盐和大分子酸三大类。
•
生物碱的沉淀反应可以检查中药制剂中生物碱的存在,
当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉淀组成恒定时,还可
以用于中药制剂中生物碱成分的含量测定。
•
4.显色反应
• 生物碱与一些浓无机酸为主的试剂反应产生不同的
颜色,这些呈色反应多用于检识和区别纯品生物碱,
而较少用于中药制剂中生物碱成分的分析。
• 生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料(多为
磺酸肽类)生成有色络合物,可被氯仿等有机溶剂定
量提出.
• 还有些结构中具有酯键的酯碱如乌头碱等可与异羟
肟酸铁试剂反应产生紫红色,这些特点可用于中药制
剂中生物碱成分的分析。
5.碱性
• 大多数生物碱呈碱性反应,能使红色石蕊试纸变蓝。生
物碱之所以能显碱性,是因为它们分子中氮原子上的孤电
子对对质子有一定程度的亲和力,因而表现出碱性。
6.紫外光谱特征
• 结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收,其中包括
结构母核即为共轭体系的和只有部分结构为共轭系统的。
• 紫外光谱的吸收峰位置除与其他化合物一样与共轭系统
中助色团的种类、位置、数量有关外,需要特别指出的是,
结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱,
其吸收峰位置还与测定时溶剂的pH有关。
二、生物碱类成分分析方法
(一)单体生物碱分析
1、定性鉴别
沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法,主要利用生物
碱能与一些试剂生成沉淀这一特性。此反应一般在酸性水
溶液中进行。
2、单体生物碱的含量测定
(1)薄层色谱法
此法简便、快捷。选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别严格,但
比鉴别严格。
(2)高效液相色谱法
可用液-液分配色谱法、液-固吸附
色谱法以及离子交换色谱法。
(3)气相色谱法
(二)中药中生物碱分析
1、总碱分析
(1)定性鉴别
由于中药制剂中成分复杂,有些成分如蛋白质、多肽和
鞣质等也可与试剂生成沉淀而造成假阳性结果,因此,制
备样品供试液时必须净化处理,除去干扰成分,方能用沉
淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别.
(2)总生物碱的含量测定
• 化学分析法
化学分析法包括重量分析法和容量分析法。目前主要使
用酸碱滴定法。
强碱滴定生物碱盐时,在70%-90%的乙醇介质中终点比
在水中明显,因此常将生物碱盐溶于90%乙醇,再用标准碱
乙醇液滴定.
酸碱滴定法指示反应终点可用指示剂和各种电位法。
• 分光光度法
目前多用单波长光度法,测定波长可选用待测生物碱
成分本身的吸收波长,也可加入某些试剂如亚硝酸钠试剂、
雷氏盐试剂及酸性染料等反应显色后用可见光波测定。
常用方法:直接测定、离子对萃取比色法
• 直接测定
不经过化学反应,利用生物碱物质自身的光吸收直接进行
比色测定的方法;
一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂中总生物碱的
含量测定;
2、离子对萃取比色法
酸性染料比色法
• 应用本法的关键在于介质的pH、酸性染料的种类和有机
溶剂的选择;
• 常用的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚兰(BTB)和溴甲
酚绿等;
• PH的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性(pKa)大小来
确定;
• 选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢键
以及形成氢键能力的强弱而定.
• 氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键,有中等程度的提取率,
且选择性也较好,故是常 用的提取溶剂.
3、高效液相色谱法
• 以反相高效液相色谱应用较多。在
反相高效液相色谱中,由于硅胶表面残
留硅醇基的影响,使生物碱分析易产生
保留时间延长、峰形变宽、拖尾.可采
取改进流动相、固定相等措施以克服游
离硅醇基的影响,满足定量定量分析的要求.
中药制剂中生物碱成分时行高效液相色谱法测定时,使用
较多的是紫外检测器.
4、气相色谱法
只适用于有挥发性的、
遇热不分解的生物碱类;生
物碱盐在急速加热过程中
产生的酸对色谱柱和检测
器不利,应该注意.
制备供试品溶液时一般应采用冷提取,净化过程也
要避免加热,以防成分流失,最后需用氯仿等低极性有
机溶剂为溶媒制备成供试液.
2、各生物碱组分分析
根据总生物碱中各生物碱的性质差异,如碱性
差异、极性差异。通常采用色谱法对每种生物碱
进行分离后分析
(三)应用示例
戊已丸中生物碱的含量测定
处方组成:黄连、吴茱萸(制)、白芍(炒)。
取本品粉末(过三号筛)0.7-0.9g,精密称定,置索
氏提取器中,加盐酸-甲醇(1:100)适量,加热回
流至提取液无色,提取液浓缩后移至25ml量瓶中,
加乙醇稀释至刻度,摇匀。精密量取5ml,置氧化铝
柱(内径约0.9cm,中性氧化铝5g,湿法装柱,用乙
醇30ml预洗)上,用乙醇35ml洗脱。收集洗脱液,
置50ml量瓶中,加乙醇稀释到刻度,摇匀,照分光
光度法,在345nm处测定吸收度,按盐酸小糪碱的
吸收系数728计算,即得。本品按干燥品计算,每1g
含生物碱以盐酸小糪碱(C20H18ClNO4)计,不得少于
30mg。
第二节 蒽醌类成分分析
一、概述
• 中药中醌类化合物主要有苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种类
型。
• 其中以蒽醌类化合物最为多见,包括蒽醌及其不同还原程
度的产物和二聚物,如蒽酚、氧化蒽酚、蒽酮、二蒽酮、
二蒽醌等。
• 这些化合物在中药中可游离存在,也可与糖结合成苷,称
为蒽苷。
二、结构特征及理化性质
(一)结构类型及特征
苯醌类
苯醌类化合物从结构上可分为邻苯醌及对苯醌两
大类。因前者不稳定,故天然存在的苯醌化合
物多为对苯醌的衍生物,且在醌核上多有-OH、
-OCH3、-CH3等基团或更长的烃类侧链。
6
5
O
1
4
O
对苯醌
O
2
6
3
5
1
2
3
4
邻苯醌
O
2、萘醌类
萘醌化合物从结构上考虑可以有α(1,4)、β(1,2)及
amphi(2,6)三种类型。但迄今为止从自然界得到的几乎均
O
O
为α-萘醌类。
8
8
1
1
9
7
6
5
10
4
O
2
7
3
6
α-(1,4)萘醌
9
5
10
β-(1,2)萘醌
4
O
2
3
O
O
amphi-(2,6)萘醌
3、菲醌类
天然菲醌衍生物包括邻醌(A)及对醌(B)两种类型。
O
OH
O
R
O
R2
O
O
R1
(A)
(B)
4、蒽醌类
蒽醌类成分包括蒽醌衍生物及其不同还原程度的产物,
如氧化蒽酚、蒽酚、蒽酮及蒽酮的二聚物等。
8
7
6
O
[H]
O
蒽醌
O
[O]
O
8a 9 9a
1
10a 10 4a
4
5
O
2
3
O
OH
[H]
[O]
OH
氧化蒽酚
蒽酮
蒽酚
理化性质
1、溶解性
• 苯醌及萘醌多以游离状态存在;而蒽醌类则
往往结合成苷存在于植物体中;
游离的醌类多具有升华性;
• 小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性,能随水
蒸气蒸馏,可据此进行提取、精制工作。
• 游离醌类多溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿等有
机溶剂,微溶于或不溶于水。
• 结合成苷后极性增大,易溶于甲醇、乙醇中,
在热水中也可溶解,几乎不溶于乙醚、苯、
氯仿等非极性溶剂中。
2、酸碱性
• 蒽醌类化合物分子中多具有酚羟基,
故具有一定酸性,在碱性水溶液中易溶,
但加酸酸化时又可重新沉淀析出,所谓
碱提取—酸沉淀即是根据这个道理进行
的。
• 根据以上性质,醌类化合物的提取可
采用碱提取-酸沉淀法。
3、显色反应
醌类的颜色反应主要取决于其氧化还原性质以及存在的酚
羟基的性质。
•碱性条件下的呈色反应:羟基蒽醌类在碱性溶液中会引起
颜色改变并加深。
•与金属离子的反应:在蒽醌类化合物结构中,如果有α-酚
羟基或具有邻位二酚羟基时,则可与Pb2+、Mg2+等金属
离子形成络合物。与Pb2+形成的络合物在一定pH条件下
能沉淀析出,故可用于该化合物的精制。
•与对亚硝基二甲基苯胺反应:9位或10位未取代的羟基蒽
酮类化合物,尤其是1,8-二羟基衍生物,酮基对位的亚甲
基上的氢很活泼,可与对亚硝基二甲基苯胺反应,缩合产
生各种颜色。
三、定性鉴别
1、显色反应
将中药制剂用适当方法提取分离,制成供试品液,
利用碱性条件下的呈色反应或醋酸镁显色反应等可对
羟基蒽醌类成分进行鉴别。
2、升华法
游离的蒽醌及其他醌类衍生物多具有升华性。中药
制剂中如含有这类成分量较大,可采用升华法得到升
华物,可见光下观察或加碱性试液显色定性。如大黄
流浸膏的鉴别。
3、薄层鉴别
1)吸附剂:多用硅胶
2)展开剂:
A:乙酸乙酯-甲醇-水(100:16.5:13.5或相近的比
例),适于他离蒽醌苷元和蒽醌苷。
B:正丙醇-乙酸乙酯-水(4:4:3)和异丙醇-乙酸乙酯
-水(9:9:4),适于分离番泻苷和二蒽酮苷
C:不含水或甲醇的混合溶媒适合于他离蒽醌类的苷元。
3)显色方法:主要有喷碱性试剂或醋酸镁甲醇液、氨气
熏及在紫外灯下观察荧光,亦可在可见光下直接观察色
斑。
四、含量测定
蒽醌类成分含量测定
1、游离蒽醌的测定
• 中药中含有游离蒽醌的量一般不高,且为脂溶性的,故此
部分另用弱极性溶剂如乙醚、氯仿等提取后加碱比色测定。
2、结合蒽醌的测定
•通常是取游离蒽醌测定项下的药渣将苷提出,水解成苷元后
再测定;
•将药渣先行酸水解,然后用非极性溶剂提取苷元后测定;
•取待测样品先行酸水解,然后用非极性溶剂提取苷元后测定,
其结果为总蒽醌含量,从中减去游离蒽醌含量,即得结合蒽
醌的含量。
3、蒽醌类单体成分的测定
•中药制剂中蒽醌类单体成分的测定一般要将样品水解
后再进行测定,测定方法主要有薄层扫描法和高效液相
色谱法。
• 薄层扫描法为蒽醌类成分常用定量分析方法,经层析
分离后,可在可见光、紫外光及荧光下扫描测定。
• 蒽醌类成分在紫外及可见光下均有强吸收,利用高效
液相色谱-紫外可见光检测器测定蒽醌类单体成分,具
有灵敏、准确、简便等特点。在含蒽醌类化合物的中药
制剂分析中应用日趋增多。
第三节 黄酮类成分分析
一、概述
• 黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于自然
界的一大类化合物。多具有颜色,在植物体内大
部分与糖结合成苷,一部分以游离形式存在。
• 黄酮类化合物最集中的是被子植物,类型最全,
结构最复杂,含量也高。由这些中药参与配伍的
中药制剂也较多见。
二、结构特征及理化性质
(一)结构特征
黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物,
现在则是泛指两苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系
列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷,一部分以游
离形式存在。
根据基本结构又可分为黄酮、黄酮醇、双黄酮、异黄酮、
二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄烷等
类型。
多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉
共轭体系,故在200-400nm波长区域内有强烈的吸收带,
此是光谱法及色谱—光谱法分析的基础。
大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基,可与聚酰胺形成氢
键,可用聚酰胺色谱法进行分析。
(二)理化性质
1、物理性状
黄酮类化合物多为晶性固体,少数(如黄酮苷)
为无定形粉末。
游离的苷元中,除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷
及黄烷醇有旋光性外,其余则无。苷类由于在结构
中引入糖的分子,故均有旋光性,且多为左旋。
2、溶解度
• 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态(苷或苷
元,单糖苷、双糖苷或三糖苷)不同而有很大差异。
• 游离苷元难溶或不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙
酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。
• 黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中,
但难溶或不溶于苯、氯仿等。
3、酸碱性
酸性:黄酮类化合物因分子中多有酚羟基,故显酸
性,可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰
胺中。
碱性氧原子的性质
• 黄酮类化合物分子中γ-吡喃酮环上的1-位氧原子,因
有未共用的电子对,故表现出微弱的碱性,可与强无
机酸,如浓硫酸、盐酸等生成盐,常表现出特殊的颜
色,可用于鉴别。
• 生成的盐极不稳定,加水后即可分解。
4、显色反应
• 还原反应:与盐酸—镁粉(或锌粉)反应,
• 金属盐类试剂的络合反应:黄酮类化合物分子中多有
下列结构,故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂反
应,生成有色络合物。
o
OH
O
O
OH
OH
OH
铝盐:常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶液。生成的
络合物多为黄色(λmax=415nm),并有荧光,可用于
定性及定量分析。
铅盐:常用1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液,可生成黄
至红色沉淀。据此不仅可用于鉴定,也可用于提取及分
离工作。
锆盐:多用2%二氯氧化锆甲醇溶液。黄酮类化合物分
子中有游离的3-或5-OH存在时,均可反应生成黄色的
锆络合物。但两种锆络合物对酸的稳定性不同,当反应
液中接着加入枸橼酸后,5-羟基黄酮的黄色溶液显著褪
色,而3-羟基黄酮溶液的呈鲜黄色(锆—枸橼酸反应)。
5、紫外光谱特征
黄酮类由于具有2-苯基色原酮的基本结构,具有特
定的紫外吸收峰,常有两个较强的吸收带,I带在
300—400nm范围内,它是由于B环桂皮酰基引起的,
Ⅱ带为240—285nm范围内,它是由于A环上的苯甲
酰基引起的。
黄酮类化合物当加入一些位移试剂如甲醇钠、醋酸钠、
氯化铝等,可使最大吸收波长发生位移,选择性提高,
还可消除杂质的干扰,有利于含量测定。
三、定性鉴别
(一)显色反应
黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及γ-吡喃
酮环有关。
• 常用盐酸-镁粉(或锌粉)反应
• 与金属盐类试剂的配合反应
黄酮类化合物分子中有游离的3-OH、5-OH或邻二酚羟
基时可与Al3+、Zr4+、Pb2+、Sr2+等形成络合物,这
些络合物有的产生荧光或颜色加深(如Al3+、Zr4+),有
的产生沉淀(如Pb2+、Sr2+)
(二)色谱鉴别
• 吸附剂:硅胶、聚酰胺;
• 硅胶色谱分离弱极性化合物较好;
• 聚酰胺色谱他离含游离酚羟游离羟基的黄酮及其苷为
佳;
• 纤维素薄层则适用于分离多糖苷混合物;
• 显色反应:采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配
合的方法。
四、黄酮类成分定量分析
中药制剂中如含有黄酮类成分,可根据要求测定制剂中
的总黄酮含量、黄酮类单体成分的含量或二者同时测定。
• 直接测定:
黄酮类化合物具有特定的紫外吸收峰,含黄酮类化合物
的原料药及部分制剂经一定的提取纯化后,可直接于最大吸
收波长处测定其吸收度,以芦丁等为对照品计算其含量.
• 显色测定:
黄酮类化合物显色以后显色物与背景最大吸收波长差别
较大,可消除背景(即阴性空白)的干扰,以提高本法的选择性
及灵敏度.常用铝盐作显色试剂.
(二)黄酮类单体成分的含量测定
1、薄层色谱法
样品经有机溶剂或水提取后,可用硅胶、纤维素或聚酰
胺进行层析,达到分离目的。
层析后可将含有待测组分的色斑刮下,再用适当的溶剂
洗脱后,用紫外-可见分光光度法测定。
更常用的是薄层扫描仪(单波长或双波长法)直接在薄
层板上扫描测定。
2、高效液相色谱法
由于黄酮类化合物在紫外区有较强的吸收,使用
HPLC法检测灵敏度较高,故该法在黄酮类单体成分
的定量分析中最常用。
黄酮类成分的HPLC条件他为
正相和反相色谱两类,反相色
谱应用较多。
反相色谱测定多有C18键合相固定液,流动相常用
甲醇-水-乙酸(或磷酸缓冲液)及乙腈-水。检测器
主要采用紫外检测器或荧光检测器。
应用示例
双黄连口服液中黄芩苷的含量测定
处方组成:金银花、黄芩、连翘
1、色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶
为填充剂;甲醇-水-冰醋酸(50:50:1)为流动相;检
测波长274nm。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于
1500.
2、对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷对照品10mg,置
100ml量瓶中,加50%甲醇适量,置水浴中振摇使溶解,
放置至室温,稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含黄芩
苷0.1mg)。
3、供试品溶液的制备:精密量取本品1ml,置50ml量瓶中,
加50%甲醇适量,超声处理20min,放置至室温,加
50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
4、测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ul,注
入液相色谱仪,测定,即得。
本品每支含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计,不得少于
80mg。
第四节 皂苷类成分分析
一、概述
• 三萜是由30个碳原子组成的萜类化合物,大多数三萜化合
物均可看作由6个异戊二烯单位联结而成。
• 游离三萜类化合物通常多不溶于水,而与糖结合成苷后,
则大多可溶于水,振摇后可生成胶体溶液,并有持久性似
肥皂溶液的泡沫,故有三萜皂苷之称。
二、理化性质
溶解度
可溶于水,易溶于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙
醇中,几乎不溶于或难溶于乙醚、苯等极性小的有机
溶剂。
在含水丁醇或戊醇中溶解度较好,且又能与水分成
二相,可利用此性质从水溶液中用正丁醇或戊醇提取
皂苷,借以与亲水性的糖、蛋白质等分离。
三萜皂苷元能溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿等有机
溶剂,而不溶于水。
显色反应
醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard反应);
五氯化锑反应(Kahlenberg反应);
三氯醋酸反应(Rosen-Heimer反应);
冰醋酸-乙酰氯反应(Tschugaeff反应);
氯仿-浓硫酸反应(Salkowski反应)。
三、定性鉴别:
理化鉴别
泡沫反应:多用于检验含有皂苷的原料药;
化学显色反应:仅在组成药物较少的中药制剂中使用。
薄层色谱法
由于皂苷类成分大多无明显的紫外吸收,故经薄层色谱
分离,然后选用适当的显色剂显色观察,是皂苷定性鉴别
中最常用的方法。
三萜皂苷类成分进行薄层层析时通常采用硅胶为吸附剂,
也有采用氧化铝、硅藻土等为吸附剂。
薄层层析后,可选用三氯醋酸、氯磺酸-醋酸、50%及
10%硫酸乙醇液、三氯化锑、磷钼酸、浓硫酸-醋酸酐、
碘蒸气等显色剂进行显色,其中以不同浓度的硫酸乙醇液
为最常用。
四、三萜皂苷类成分的定量分析
中药制剂中皂苷类成分的定量分析可分为总皂苷测定、皂
苷元测定和单体皂苷测定。
(一)总皂苷的含量测定
1、提取分离
总皂苷的含量测定一般需要用适当的溶剂提取。由于皂苷
在极性溶剂中溶解度较大,因此提取溶剂可为各种浓度的甲
醇(70%-95%)、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇。
提取后经分离得到总皂苷成分,分离可用有机溶剂,如水
饱和的正丁醇萃取,
也可用大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱。
2、测定方法
重量法
该方法主要用于含皂苷的原料药质量控制。
在中药制剂中,如处方中药味含皂苷类成分较多时,常用
正丁醇作溶剂,测定正丁醇浸出物。
比色法
常用三萜皂苷显色剂有香草醛-硫酸、香草醛-高氯酸、醋
酐-硫酸、高氯酸、浓硫酸以及亚甲蓝等。
用比色法测定中药制剂中总皂苷或总苷元的含量时,可选
用单体皂苷或皂苷元作对照品,但要注意测定单体皂苷或
皂苷元与总皂苷的换算系数。
(二)皂苷元的含量测定
皂苷元的获得:
得到总皂苷后,加酸(如硫酸、盐酸)加热水解,得到
皂苷元;
将样品先行水解,再用有机溶剂从水解后的溶液中提取
皂苷元。
测定方法:主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和比色
法。
(三) 三萜皂苷类单体成分含量测定
1、薄层色谱法
样品经适当的提取、纯化后,用薄层色谱法分离,可
排除其他组分的干扰,常用于测定中药制剂中的皂苷元
或单体皂苷,定量方法可采用薄层洗脱—比色法或薄层
扫描法。
2、高效液相色谱法
大多数三萜皂苷类成分,如人参皂苷、三七皂苷等可
利用其在紫外区的末端吸收来检测,但灵敏度相对要低。
若中药制剂中所含三萜皂苷类成分本身具有较强的紫
外吸收,如甘草酸、远志皂苷等,可用HPLC分离并用紫
外检测器检测。
蒸发光散射检测器(ELSD)用于高效液相色谱法检测
三萜皂苷类成分的应用日渐广泛。
第五节 挥发性成分分析
一、概述
• 挥发性成分是指中药中一类具有芳香气并易挥发
的成分,其化学组成复杂,主要包括挥发油类成
分和其他分子量较小、易挥发的化合物。挥发油
为易流动的油状液体,具香味和挥发性,可随水
蒸汽蒸馏。
二、结构特征及理化性质
(一)结构特征
挥发油中成分按化学结构分类,可分为萜类化合物、脂肪族化合
物及芳香族化合物等。
显色反应
挥发油中若含有酚类成分,加入三氯化铁的乙醇溶液,可产生蓝
色、蓝紫色或绿色反应;
若含有羰基化合物,加入苯肼或苯肼衍生物、羟胺等试剂,可生
成结晶性的衍生物;
若含有醛类化合物,加入硝酸银氨试液,可发生银镜反应;
若含有内酯类化合物,于样品的吡啶溶液中加入亚硝酰铁氰化钠
及氢氧化钠溶液,出现红色并逐渐消失;
若含有不饱和化合物,于样品中加入溴,红棕色褪去;
若含有奥类衍生物,加入浓硫酸,可产生蓝色或紫色反应。
(二)薄层色谱法
挥发油成分薄层色谱的条件主要是根据极性大小加以
分离的。油中所含各类化合物的极性顺序为:
烃(萜)<醚<酯<醛、酮<醇、酚<酸
因此可试用不同极性的展开剂进行分离
常用的吸附剂为硅胶、氧化铝等,其中以硅胶常用
常用展开剂为石油醚或正己烷,可使不含氧的烃类成
分展开,而含氧化合物一般留在原点。
四、含量测定
含量测定可分为总挥发油和单一成分的测定。
总挥发油的测定,采用挥发油测定器,用蒸
馏法测定,可分别测定相对密度在1.0以下和
1.0以上的挥发油含量。
单一成分测定:主要采用气相色谱法和薄层
色谱法。
第六节、多糖、有机酸类成分分析
一、多糖的鉴别与含量测定
(一)多糖的鉴别
1. 薄层色谱法
• 多糖可采用酸水解法将其水解成较小片段,然后
进行薄层色谱鉴别。
• 硅胶色谱,纤维素色谱,硅藻土色谱及氧化铝色
谱。由于糖是多羟基化合物,极性强容易吸附。
• 采用含有无机盐水溶液,如0.3mol/L磷酸二氢钠
水溶液制备硅胶薄层板,使硅胶薄层吸附能力降
低,斑点集中,对分离有所改善,样品承载量显
著提高。
2. 纸色谱法
• 多糖可采用酸水解法将其水解成单糖,然后进行
纸色谱;也可用某些系统直接将多糖展开。
(二)多糖的含量测定
1、单体多糖的含量测定
• 单体多糖多采用高效凝胶液相色谱法,
• 以已知分子量的多糖对照品作对照,确定其分子量。
• 再将其酸水解后进行高效液相色谱法测定,确定其组成
(单糖的种类及比例),以单糖的量推算多糖的量。
• 检测器多为示差折光检测器,
• 通常用氨基键合硅胶柱分离,但其稳定性差,用硅胶柱动
态改性,可避免这一问题。
2、总多糖的含量测定
• 3.5-二硝基水杨酸(DNS)比色法
在碱性溶液中,3.5-二硝基水杨酸与还原糖生成棕红色氨
基化合物,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度
呈比例关系,利用比色法可测定样品中糖含量。
• 苯酚-硫酸法
苯酚-硫酸试剂可与游离的或多糖中的已糖,糖醛酸起显色
反应,已糖在490nm波长处,戊糖及糖醛酸在480nm波
长处有最大吸收,吸收度与糖含量呈线性关系。
• 蒽酮-硫酸法
糖类与硫酸发生脱水反应,生成糠醛或其衍生物,可与蒽
酮试剂缩合产生颜色物质,反应后溶液呈蓝绿色,于
620nm波长处有最大吸收,吸收度与多糖含量呈线性关
系。
第七节 其他类型成分分析
(一)概述
概念:有机酸按结构可分为三类,即脂肪类、芳香族类
和萜类。按羧基数目可分为单羧基酸、二羧基酸和三羧基
酸。
(二)定性鉴别薄层色谱法
 吸附剂:常用硅胶、聚酰胺等。
 展开剂:常用极性较大的溶剂,为防有机酸展开过程中发
生离解,常在展开剂中加入一定比例的甲酸或乙酸等以消
除因解离而产生拖尾现象。
 显色剂:常用pH指示剂,如溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴酚
蓝、磷钼酸试剂等。
 具有荧光的物质如绿原酸、阿魏酸等,可不必显色,在荧
光灯下观察荧光。
(三)含量测定
酸碱滴定法
本法适合于测定总有机酸类成分,由于中药中有机酸类
成分酸性弱,在水溶液中滴定突跃不明显,可用非水溶
液滴定法。滴定液颜色较深时,影响观察滴定终点,采
用电位法指示终点。
高效液相色谱法
芳香族酸类和其他具有紫外吸收的酸类,可用高效液相
色谱法进行含量测定,如绿原酸、没食子酸、桂皮酸、
丹参素、阿魏酸等。
分光光度法
可用单波长法、双波长法、导数分光光度法测定有机酸
的含量。
二、环烯醚萜类成分分析
(一)概述
环烯醚萜:一类特殊的单萜,由二个异戊二烯构成,
含有10个碳原子,其母核都为环状,具有烯键和醚键,
常与糖结合成苷。
溶解性:大多易溶于水、甲醇,可溶于乙醇、丙酮、
正丁醇。
对酸敏感:成苷后苷键易被水解断裂,苷元结构中C1
的羟基和C2位的氧是一个半缩醛结构,化学性质活泼,
易发生进一步氧气化聚合等反应,尤其在酸碱作用下更
易变化。
(二)定性鉴别
利用薄层色谱可对环烯醚萜苷类成分进行定性鉴别。
薄层板:(1)硅胶G;(2)硅胶GF254;(3)聚酰胺薄膜。
显色剂:(1)硫酸乙醇溶液;(2)茴香醛试液;(3)香草
醛硫酸试液;(4)对二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液。
(三)含量测定
高效液相色谱法:对于有紫外吸收的环烯醚萜苷类成分可用
该项法进行分析。
薄层扫描法:可用硅胶GF254薄层,检测荧光熄灭斑点;也
可用硅胶G薄层,用显色剂显色后测定。
分光光度法:利用环烯醚萜苷与某些试剂的呈色反应,于分
光光度计上测定吸收度进行定量分析。
三、香豆素类成分分析
(一)概述
概念:香豆素是一类内酯衍生物,具有芳香气,分子中
苯环或吡喃酮环上常有取代基存在,按其基本的环状结构
形式,分为简单香豆类、呋喃香豆素类、吡喃香豆素类、
其他香豆素类。
(二)理化性质
显色反应
①异羟肟酸铁反应内酯环在碱性条件下开环,与盐酸羟胺
缩合成异羟肟酸,然后再在酸性条件下与三价铁离子配合
成盐而显红色。
②与酚羟基反应
• 具有酚羟基取代的香豆素类在水溶液中可与FeCl3试剂产
生颜色。
• 若香豆素化合物的C6位上(即酚羟基的对位)没有取代
基,则能与Gibbs试剂反应显蓝色。
• 香豆素类成分在碱性溶液中加热,使内酯环开裂,若酚羟
基对位无取代基,则可与重氮化试剂反应生成红色偶氮染
料。
紫外光谱特征
化合物的结构中羰基和芳环形成较强的共轭体系,因此在
紫外光区具有很强的特征吸收,紫外吸收光谱一般在
300nm左右(lgε为4左右)有最大吸收,吸收峰的位置与
取代基有很大关系。
香豆素母核本身无荧光,而羟基香豆素在紫外光下大多数
能显蓝色荧光,这是因为羟基能增强分子荧光的缘故。
香豆素类荧光的有无或强弱与分子中取代基的种类和位置
有关。
香豆素的荧光性质在薄层色谱中可用于定性鉴别和定量分
析。
(三)定性鉴别
荧光法
羟基香豆素大多能产生荧光,利用此性质可进行定性鉴
别。可直接观察提取溶液的荧光,也可观察薄层斑点荧光。

薄层色谱法
具有荧光的香豆素类成分,可用薄层色谱荧光法进行鉴别
不具荧光或荧光强度较弱的香豆素可用显色剂或喷洒碱溶
液以增强荧光再进行观察。
(四)含量测定
1、分光光度法
利用香豆素类成分的颜色反应,生成有色物质,于可见
光波长区域进行测定。
香豆素类成分都具有紫外吸收,样品较纯净时,也可于
紫外光区域直接测定。
2、薄层扫描法
本法为香豆素类成分常用测定方法之一,样品经薄层分
离后,于荧光灯下定位,利用香豆素类成分具有紫外吸收
或能产生荧光的特性,不经显色,直接进行扫描测定。
3、荧光光度法
• 羟基香豆素类成分大多能产生较强烈荧光,用荧光光度法
进行测定有较高的灵敏度。
• 当干扰成分较多时,可先用薄层分离,刮取薄层洗脱被测
成分后再用荧光光度法进行测定,但本法不及薄层扫描法
简便,刮取薄层洗脱时易引起误差。
4、高效液相色谱法
香豆素类成分含有芳香环及其它共轭结构,用HPLC
测定时,有较高的灵敏度,
常用固定相为C18,流动相为不同比例的甲醇—水
5、气相色谱法
 某些分子量小、具有挥发性的香豆素类成分,可用
气相色谱法测定,如蛇床子素、欧前胡素、香柑内酯、
异虎耳草素、花椒毒素、花椒毒酚等成分可用GC测定,
常用SE-30石英毛细管柱,FID检测器。
四、单萜及二萜类成分分析
1、含芍药苷中药制剂的分析
(1)定性鉴别
可用硅胶GF254薄层板分离后于紫外光灯(254nm)下
直接观察,但斑点色泽较浅,也可用显色剂显色后进行鉴
别。
显色剂有:10%硫酸乙醇溶液;5%香草醛硫酸溶液;
5%茴香醛-5%硫酸乙醇溶液;稀盐酸;碘蒸气。
(2)含量测定
具有紫外吸收,但不能产生荧光,在硅胶GF254薄板上
可产生暗色斑点,所以芍药苷常用的定量方法为高效液相
色谱法和薄层扫描法。
2、含穿心莲中药制剂的分析
结构中含有α、β不饱和内酯,其紫外吸收光谱为
λmax223nm,可利用此结构特性进行鉴别和含量测定 。定
性鉴别:

多采用薄层色谱法进行鉴别
具有紫外吸收,在硅胶CF254薄层板上呈现暗斑点,也可用
硅胶G薄层,用显色剂显色后进行观察。
常用的显色剂:A碘蒸气;B2%的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶
液与7%氢氧化钾溶液的等量混合液。

• 穿心莲总内酯的测定
可根据内酯结构在pH=8以上水解开环的性质,用氢氧
化钠水解,以酸回滴剩余碱间接测定总内酯含量;
• 穿心莲单体内酯的测定
薄层分离后用紫外分光光度法、薄层扫描、高效液相色
谱法测定
应用示例
桂枝茯苓丸中肉桂酸的含量测定
处方组成:桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁
1、色谱条件和系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶
为填充剂;乙腈-0.1%磷酸溶液(30:70)为流动相;检
测波长为285nm。理论塔板数按肉桂酸峰计算应不低于
2000.
2、对照品溶液的制备:精密称取肉桂酸对照品10mg,置
100ml棕色量瓶中,用50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀、
精密量取5ml,置100ml棕色量瓶中,加50%甲醇至刻度,
摇匀,即得(每1ml含肉桂酸5ug)。
3、供试品溶液的制备:取本品10g,切碎,混匀,精密称
定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,称定重
量,超声处理30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇
补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
4、测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul,
注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每丸含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计,不得少于0.072。
• 参考资料
1、《中药制剂分析》,梁生旺,中国中医药
出版社。
2、《中药化学》,匡海学,中国中医药出版
社。
3、《天然药物化学》第六版,姚新生,人民
卫生出版社。

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