荧光探针法测定蛋白质含量

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荧光探针法测定
蛋白质含量
问题思考:
1.什么是荧光?
2.什么是蛋白质
的荧光探针?
蛋白质的荧光探针
是一类比蛋白质
荧光发射更强的荧光
染料,它吸附或共价
结合在蛋白质上,使
蛋白质的荧光特性发
生变化,从而可以研
究蛋白质的结构和测
定蛋白质。
本实验采用长链水溶性
磺酸吲哚探针——二聚
体吲哚类探针I作为血清
蛋白的生物荧光染料,
为血清蛋白的测定建立
了一种简便,灵敏、稳
定的新型荧光探针检测
分析体系。
实验原理
如图,当pH=2.50,吲哚探针I的荧光激发
波长为548 nm,发射波长为562 nm(图1曲线
1),stokes位移14 nm。加入牛血清蛋白BSA
后,荧光强度明显增强,发射波长发生红
移。
 在酸性条件下,血清蛋白分子带正电,吲哚
探针I带有多个负电荷磺酸基团,探针I可以通过
电荷吸引接触蛋白分子,并与蛋白质分子中的氨
基、羧基及巯基等基团形成氢键,结合在蛋白质
分子上,使得探针周围微环境非极性增强,探针
受水分子作用而导致的荧光能量损失现象得到有
效抑制,体系荧光得到增强
如图1所示,随着BSA浓度的增加,荧光强度逐渐
增大(曲线2~8),荧光波长明显红移
 同时,随着蛋白质浓度的增加,蛋白质a螺
旋结构逐渐转为折迭态,a螺旋结构紧密程
度增加,嵌入结合在蛋白分子内部的探针
自由扭动现象受阻,探针能量传递效率增
大,体系荧光强度逐渐增大
实验仪器
 Car,/Eclipse荧光光度计(Varian,USA)
 FA1104N电子天平(上海)
 PHS一3C型精密酸度计(上海)
实验试剂
 牛血清蛋白(BSA)以水配制成浓度为1.00
ms/ml的贮备液
 吲哚类探针I(实验室合成),以水配制成浓
度为3.0×10一mol/L的贮备液
 柠檬酸钠一HC1缓冲液(pH=2.50)
实验方法
 在10 mL的容量瓶中依次加入3.0×10-5
mol/L吲哚探针溶液1.0 mL,柠檬酸钠HC1缓冲溶液2.0 mL
 混匀后,加入适量的50.0 t~g/mL牛血清
蛋白溶液,稀释至刻度,静置5 min。
 在荧光光度计上测定荧光增强值△I=I-Io
实验条件的选择与优化
PH 的 选 择
pH影响
当pH为1.10~2.50时,BSA-探针体系的
荧光强度随pH增加而增强。
当pH 2.50时,BSA-探针体系的荧光强度
最大;
当pH2.70~4.00时,蛋白分子正电荷随
着体系酸度下降而降低,不利于探针外层
带有负电荷的磺酸离子与蛋白质分子接触,
BSA与探针结合作用减弱,荧光增强程度降
低。
探针浓度的选择
探针浓度影响
 实验表明,当探针浓度为3.0umol/L时,
n(探针):n(BSA)=40:1荧光背景强度适宜,
体系荧光增强最为明亮
 当探针浓度大于3.0 umol/L时,BSA与探
针作用趋向饱和,但随着探针浓度的上升,
游离的荧光探针浓度增大,荧光背景值增
强,BSA一探针有效吸收激发光的几率降低,
体系荧光增强程度降低
NaCl 浓度的选择
NaC1离子强度的影响
 随着NaC1浓度增大,离子强度增大,蛋白
分子结构形态可能产生部分改变,与染料
的结合能力下降,体系荧光强度快速下降;
 当NaC1浓度大于0.125mol/L,离子强度
较大,较低浓度的蛋白分子a螺旋结构可能
从紧密折迭态完全转变为展开状态,与探
针嵌入作用较低,体系荧光强度趋向稳定。
实验评价
本实验灵敏度高、操作简便且BSA-探针体
系荧光强度增大值与BSA质量浓度呈良好
线性关系,线性范围宽(0.80~25.00
ug/mL),检出限低(0.05g/mL)
但对仪器的精密度要求较高,所用仪器价格
昂贵

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