Le strutture batteriche PGN lipoproteine 12.03.2014 - e

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Le strutture batteriche
Il peptidoglicano
(PGN)
Il Peptidoglicano (PGN): [1]
• Il componente principale della parete batterica
• Responsabile della conformazione e della rigidità della parete
Il Peptidoglicano (PGN): [2]
 Preserva l’integrità della cellula batterica
L’’inibizione della biosisntesi del PGN, sia attraverso mutazioni, sia attraverso il trattamento con
antibiotici, o la rottura della struttura del PGN (lisozima) si accompagna alla lisi della cellula
batterica.
 Contribuisce al mantenimento di una forma definita
 Serve come scaffold per le altre componenti della parete
È assente in alcuni batteri: Mycoplasma, Planctomyces e in alcuni ceppi di
Rickettsia
In Chlamidia, seppur presenti i geni per la biosintesi del PGN, non è stato mai
identificato
Resistenza del PGN
• Unica grossa molecola nelle tre direzioni dello spazio
• Legami b-1,4 particolarmente forti
• Presenza di zuccheri non comuni (MurNac)
• Alternanza di aminoacidi D e L risulta in una resistenza
maggiore
• Sembra che tra i vari gruppi peptidici si stabiliscano
numerosi legami idrogeno
COMPONENTE GLUCIDICA
COMPONENTE PEPTIDICA
Catene lineare di n unità di un
disaccaride:
Corta catena di aminoacidi
(TETRAPEPTIDE) alternati negli
stereoisomeri D e L
N-acetil-D-glucosammina (NAG)
Acido N-acetil-muramico (NAM)
Il Peptidoglicano (PGN)
Il Peptidoglicano (PGN): il legame delle catene peptidiche [1]
Il Peptidoglicano (PGN): il legame delle catene peptidiche [2]
I tetrapeptidi
I tetrapeptidi si legano tra di loro con due modalità principali:
1)
DIRETTAMENTE (nei Gram negativi)
2)
INDIRETTAMENTE (nei Gram positivi)
Il Peptidoglicano (PGN): [3]
 Le catene glicaniche vengono assemblate attraverso l’oligomerizzazione di
unità disaccaridiche/peptidiche.
 Queste reazioni sono catalizzate da numerosi enzimi e vengono indicate come
reazioni di transglicosilazione.
È posibile stabilire una lunghezza delle catene glicaniche?
 La lunghezza media delle catene varia considerevolmente da batterio a
batterio e all’interno della stessa popolazione rispetto alla fase di crescita, alla
composizione del mezzo di crescita, presenza/assenza di antibiotici,
condizioni di crescita extra/intra cellulari
 Nel PGN dei Bacilli, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, lo sheletro
saccaridico ha una lunghezza compresa tra le 50 e le 250 unità saccaridiche
 Negli Staphilococchi, S. areus, le catene sembrano essere molto più corte con
una lunghezza media di 18 unità
Biosintesi del PGN
Biosintesi del PGN
 La sintesi del PGN ha luogo in tre diversi compartimenti
1. Fase citoplasmatica
2. Fase di membrana
3. Fase periplasmatica
Fase citoplasmatica
Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica
Fase di membrana
Assemblaggio del glican-pentapeptide e attraversamento della
membrana citoplasmatica
Fase periplasmatica
Polimerizzazione del PGN (reazioni di transglicosilazione) e
formazione dei legami crociati (reazioni di transpeptidazione)
Fase citoplasmatica (stage I)
Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica
Sintesi del NAG
Si parte dal fruttosio-6 fosfato e attraverso l’azione coordinata di diversi enzimi
si arriva alla formazione del primo substrato attivato del PGN: l’UDP-NAG
Fase citoplasmatica (stage I)
Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica
Nucleotide di Park
Sintesi del NAM
UDP-NAM
Fase di membrana (stage II)
Formazione del glican-pentapeptide e traslocazione nel periplasma
Bactoprenolo
Fase di membrana (stage III)
Polimerizzazione del PGN e formazione dei legami crociati
Fase di membrana (stage III)
Polimerizzazione del PGN e formazione dei legami crociati
 Sintasi mureiniche
Enzimi presenti fino a circa 200 copie per cellula batterica
Possono essere
1. monofunzionali e quindi agire o come transpeptidasi (TP) o come transglicosilasi
(TG)
2. Bifunzionali: hanno attività sia di TP che TG
• Tutte le sintasi mureiniche sono ancorate alla membrana citoplasmatica grazie a un
dominio transmembrana adiacente la regione N-terminale (citoplasma)
•Il dominio catalitico è presene all’estremità C-terminale
•Un gruppo specifico di sintasi con attività TP sono le PBPs (penicillin-binding proteins)
PBPs in E. coli
Il Peptidoglicano (PGN): [4]
 Come per l’LPS anche per il PGN esistono numerose modificazioni, che si
realizzano sia a carico dello scheletro glucidico, sia a livello della componente
proteica.
1. le modificazioni della componente saccaridica possono essere fatte
rientrare nelle seguenti categorie: deacetilazione, acetilazione,
glicolilazione
2. Le variazioni della componente peptidica (peptide stem) sono ascrivibili a
due meccanismi:
a) azione degli enzimi Mur (durante la biosintesi)
b) fasi tardive della biosintesi: amidazione, acetilazione,
idrossilazione, aggancio di gruppi proteici
Le maggiori variazioni si osservano a livello dell’aminoacido in terza
posizione!
Il Peptidoglicano (PGN): Modificazioni nella componente
glicanica
Modificazioni nella componente glicanica [1]: la
deacetilazione
 Osservata inizialmente in ceppi di S. pneumoniae reisistenti all’attività del
lisozima: una significativa proporzione dei residui di GlcNAC risulta
deacetilata
 B cereus, B. anthracis, L. monocytogenes, E. faecalis, H. pylori
 In S. pneuomniae è stato identificato il gene responsabile di questa modifica:
pgdA (peptidoglycan deacetilase A)
 PgdA appartiene a una superfamiglia di proteine: le esterasi saccardidiche di
classe 4
 I membri di questa famiglia presentano due caratteristiche:
1) vengono espresse come proteine con una sequenza segnale di taglio;
2) necessitano, per l’attivazione, del legame a ioni (Zn, Co, Mg)
Qual è il ruolo biologico della deacetilazione del PGN?
 La presenza di amminozuccheri deacetilati nella composizione del PGN
riduce drasticamente l’attività del lisozima
 Lisozima: enzima con attività muramidasica ubiquitariamente presente nei
liquidi corporei e nelle secrezioni, nei fagociti (granuli), cellule del Paneth
Qual è il ruolo biologico della deacetilazione del PGN?
 È possibile che l’effetto della deacetilazione del PGN non sia limitato alla
riduzione dell’attività enzimatica del lisozima
 La deacetilazione introduce cariche positive nella parete cellulare con
conseguente modulazione dei legami con altre strutture batteriche di
superficie (proteine) o altri componenti batterici (capsula polisaccaridica)
 Maggiore resistenza del batterio ai peptidi cationici antimicrobici (AMPs))
dell’ospite
 La deacetilazione può alterare/modulare il riconoscimento di un patogeno
attraverso i PRRs: L. monocytogenes, mutante pgdA risposta interferonica
(IFN-b) attraverso il riconoscimento mediato da TLR2 e NOD1
Modificazioni nella componente glicanica [2]: la
glicolilazione del MurNAC
 Osservata inizialmente in ceppi di M. smegmatis
 Rappresenta un marker di molti generi batterici
appartenenti al phylum degli Actinobatteri (Gordonia,
Nocardia, Rhodococcus)
 L’aggiunta di un ulteriore gruppo idrossile si realizza
durante il pathway biosintetico del PGN
Qual è il ruolo biologico della glicolilazione del PGN?
 Il gruppo idrossilico sembra partecipare alla formazione di nuovi legami
idrogeno con componenti della parete, conferendo maggiore stabilità e
resistenza alla parete stessa
 Mutanti di M smegmatis nel gene namH sono più suscettibile all’azione del
lisozima e degli antibiotici b-lattamici
Modificazioni nella componente glicanica [3]:
l’acetilazione del MurNAC
 Aggiunta di un secondo gruppo idrossilico al C6 con
formazione di un residuo di diacetil muramico
 L’acetilazione del residuo di MurNAC è la
modificazione che si presenta con maggiore
frequenza nei Gram positivi e negativi
 Il grado di acetilazione del residuo di MurNAC varia
considerevolmente tra le specie batteriche e tra i
diversi ceppi batterici (dal 20 al 70%)
Modificazioni nella componente glicanica [3]:
l’acetilazione del MurNAC
 Gene oatA (O-acetil transferasi) di S. aureus e adrA di S. pneumoniae
 Enzimi transmembrana (11 regioni predette transmembrana) con la regione
carbossi-terminale extra-citoplasmatica con attività catalitica
Qual è il ruolo biologico dell’acetilazione del PGN?
 Maggiore resistenza all’azione del lisozima
 Negli Staphilococchi sembra esserci una chiara correlazione tra patogenicità,
resistenza all’attività muramidasica del lisozima e grado di acetilazione del
MurNAC
 Persistenza di frammenti di PGN con residui di MurNAC acetilati:
modulazione del riconoscimento dei patogeni da parte del sistema
immunitario innato
 Il grado di acetilazione dei residui di MurNAC sembra essere ridotto in
seguito al trattamento con antibiotici b-lattamici (Neisseria spp., S. aureus, P.
mirabilis)
 In N. gonorrhoeae esiste una proporzionalità diretta tra il grado di
acetilazione del MurNAC e l’attività della carbossipeptidasi PBP2
Il Peptidoglicano (PGN): [5]
 La componente peptidica rappresenta il punto di ancoraggio di proteine della
parete cellulare al PGN: nei batteri Gram negativi, la lipoproteina di Brown
O
O
CH2 CH
NH
CH2 S
Cys
(aa)56
Lys
NH2
COOH
D-Ala
m-Dap
NH2
D-Glu
PEPTIDOGLICANO
XXXXXXXXXXXXXX
L-Ala
GlcNAc
MurNAc
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
Il Peptidoglicano (PGN): [6]
 La componente peptidica rappresenta il punto di ancoraggio di proteine della
parete cellulare al PGN: nei batteri Gram negativi, la lipoproteina di Brown
 Il legame della BLP al PGN avviene attraverso reazioni di
transpeptidazione
 Nei batteri Gram positivi ancorate al PGN numerose componenti. Le reazioni
di ancoraggio sono catalizzate dalla SortasiA
Metabolismo del PGN
• Gram positivi: le unità neosintetizzate
vengono inserite nel versante interno, prima
che la degradazione possa iniziare (INSIDE
TO OUTSIDE)
• Gram negativi: tre nuovi filamenti vengono
inseriti contemporaneamente alla rimozione di
un filamento vecchio (THREE FOR ONE)
“Three for one”
Complesso “Yin-Yang”
Complesso multienzimatico che
combina l’attività di:
-Transglicosilasi litiche (LT)
-Endopeptidasi (EP)
-Amidasi (AM)
-Transpeptidasi (TP)
-Transglicosilasi (TG)
Processo di recycling nei Gram• Durante la crescita batterica, circa il 40-50% del PGN
viene degradata nel corso di ogni generazione
• I prodotti di turnover si accumulano nello spazio
periplasmatico
• Il 90% dei prodotti di turnover viene riciclato e
reincorporato nel sacculo stesso
• Il 10% del materiale degradato viene rilasciato
nell’ambiente
“Three for one”
Il PGN: gli enzimi del recycling
Membrana esterna
PERIPLASMA
MUREINA
ANHYDRO
MUROPEPTIDE
SltY, MltA, MltB Lytic trasglycosylases
AmiA, AmiB, AmiC Amidase
TETRAPEPTIDE
TRIPEPTIDE MppA
AmpG
periplasmic murein peptide binding
Opp
Membrana interna
muropeptide permease
oligopeptide permease
CITOPLASMA
NAG – anh-NAM – L-Ala – D-Glu – meso-DAP – D-Ala
UDP-NAM – pentapeptide
NagZ
LdcA
AmpD
UDP-NAM – D-Ala –
L-Glu – meso-DAP
L-Ala – D-Glu – meso-DAP – D-Ala
LdcA
D-Ala – D-Ala
L,D-carboxypeptidase
Β-N-acetyl- anhMurNAc-Lala amidase
glucosamidase
MpaA
UDP-NAM
L,D-carboxypeptidase
Mpl
MurF
Murein peptie amidase
L-Ala – D-Glu-meso-DAP
murein peptide ligase
L-Ala – D-Glu
meso-DAP

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