i) k - IFM

Report
Olika katalyseringsstrategier hos enzymer - summarisk översikt
• Allmän syra/bas katalys: i) Allmän bas katalys - en bas stabiliserar en positiv laddad
grupp i TS, ii) Allmän syra katalys - en syra stabiliserar en negativ laddad grupp i TS
• Approximation (Proximitet av reaktanter): Närhet av reaktanter leder till lägre
entropiförlust vid en enzymkatalyserad reaktion under de kemiska stegen jämfört med icke
enzymkatalyserad reaktion.
• Elektrostatisk katalys: Enzymer kan stabilisera joner och andra laddningar (t o m mer
effektivt än vatten) pga orienterade dipoler i aktiva ytan
• Metalljonkatalys: i) Elektrofil katalys – koordinerad metalljon som stabiliserar en
bildande negativ laddning, ii) Hydroxyljonskatalys vid neutralt pH – Koordinerande
metalljon som inbinder vatten och underlättar deprotonisering till hydroxyljon vid neutralt
pH. Hydroxyljonen kan sedan reagera med substratet via en nukleofil attack
• Kovalent katalys: i) Elektrofil katalys – ny katalysväg med bildandet av en bättre elektrofil
än ursprungselektrofilen (ex bildandet av Schiff bas, e- stabiliseras genom delokalisering),
Nukleofil katalys – ny katalysväg med en bättre nukleofil än ursprungsnukleofilen och där
intermediären är mer reaktivt än vad substratet är
• Konformationsförändring (Conformational distortion) – strukturförändring av enzymet,
substratet eller båda för att föra systemet mot TS (inducet fit and induced strain)
Kovalent katalys
11. Ge ett exempel och förklara reaktionsmekanismen för:
Nukleofil katalys – ny katalysväg med en bättre nukleofil än ursprungsnukleofilen och
där intermediären är mer reaktivt än vad substratet är
Exempelvis hydrolys av ättiksyraanhydrid underlättas av pyridin
Nukleofil attack med
pyridin som är en bättre
nukleofil än H2O
Det bildas ett intermediat som är mer
reaktivt än ursprungssubstratet
Kovalent katalys
Nukleofil katalys -
Kovalent katalys
12. Diskutera vilka faktorer som är av betydelse för reaktionshastighet hos en
nukleofil katalys vid hydrolys av en ester?
Mät förändringar i reaktivitet med förändringar i strukturen hos reagensen
Hastigheten för en hydrolys av en ester ökar då:
i)
Karbonylkolet är kopplat till elektrondragande grupper i acylpositionen
(CHCl2CO2Et > CH3CO2Et)
ii) elektrondragande grupp i lämnande gruppen
iii) ökad basisk styrka hos nukleofilen
Elektrondragande grupp i acylpositionen
Ökad basisk styrka hos nukleofilen
Elektrondragande grupp i
lämnande gruppen
Kovalent katalys
nukleofil katalys vid hydrolys av en ester
Tillämpa transitions state teorin - reaktionshastigheten beror på energiskillnaden mellan
TS och grundtillståndet → så kan vi dra slutsatsen att:
1. Reaktionen involverar en ökning av negativ laddning på substratet (eftersom
reaktionshastigheten ökar med elektrondragande grupp)
2. Reaktionen måste involvera en minskning i laddning hos nukleofilen (eftersom
hastigheten ökar vid elektrondonation)
Detta är förenligt med båda reaktionsmekanismerna nedan
Det hastighetsbegränsande
steget är formation av ett
tetraedriskt intermediat
Det hastighetsbegränsande
steget är nedbrytning av ett
tetraedriskt intermediat
Kovalent katalys
nukleofil katalys vid hydrolys av en ester
Brønsted β värde för en nukleofil katalys fås genom att plotta logk2 mot pKa för olika nukleofiler
Linjärt samband mellan logk och pKa
ΔG# för formation av bindning mellan den
nukleofila gruppen och karbonylkolet är
proportionellt mot ΔG för överföring av en
proton till nukleofilen
R NH2
A Bronsted plot för nukleofil attack av primära och
sekundära aminer på p-nitrofenylacetat
RNH2 + H+
RNH3+
Kovalent katalys
nukleofil katalys vid hydrolys av en ester
Brønsted β är inte strikt mellan 0 och 1 - kan vara större än 1 om den reaktiva gruppen är
mer elektrondragande än en proton .
β-värdet indikerar laddningsfördelningen i TS
• β för nukleofil attack av tertiära aminer på estrar med starka basiska alkoholer är:
+ 1.5 för variation av nukleofilens pKa (hastigheten ökar med stigande basstyrka)
- 1.5 för variationen av alkoholens pKa (hastigheten minskar med stigande basstyrka)
I detta fall liknar TS strukturen den bildade produkten
Det hastighetsbegränsande
steget är nedbrytning av ett
tetraedriskt intermediat
Kovalent katalys
nukleofil katalys vid hydrolys av en ester
I ett annat extremt fall
•β för reaktion med basiska nukleofiler och estrar som innehållen en aktiverad lämnande
grupp är:
+ 0.1 till 0.2 för variation av nukleofilens pKa (marginell ökning av hastigheten med
stigande basstyrka)
- 0.1 till 0.2 för variationen av den lämnande gruppens pKa (marginell minskar av
hastigheten med stigande basstyrka)
I detta fall liknar TS strukturen startmaterialet
Det hastighetsbegränsande
steget är formation av ett
tetraedriskt intermediat
1. Diskutera vilken information om en enzymatisk reaktion kan man få
genom ”steady state” kinetik versus ”pre-steady state” kinetik.
Steady state kinetik – visar med vilken hastighet produkt bildas och/eller
substrat förbrukas under steady state förhållanden.
Ger ingen information om antal intermediärer. Här kan vi beräkna KM, kcat
och kcat/KM
Pre-steady state kinetik – direkt observation av intermediärer i
reaktionsvägen och deras hastighet av bildning och nedbrytning kan
beräknas.
Pre-steady state kinetik ger information om reaktionsmekanismen genom
att påvisa uppkomst av intermediat och dess försvinnande.
2. Om inget intermediat kan detekteras i ”pre-steady state” vad kan
det då bero på?
Odetekterade intermediat i pre-steady state kan bero på:
a) Ingen accumulering av intermediet
b) Intermediatet ger ingen spektral signal
c) Intermediatet bildas så snabbt att det ej kan detekteras.
3. Vilka kriterier måste vara uppfyllda för bevis att ett intermediat
bildas i reaktionskedjan?
Ett intermediat är bevisat att vara ”on pathway” om:
a) intermediatet är isolerat och karaktäriserad +
b) intermediatet bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” +
c) intermediatet kan reagera tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
Detektion av intermediär genom dess ackumulering i ”burst-fas”,
Hydrolys av en amid/ester katalyserad av chymotrypsin kan beskrivas med följande schema:
k’1
E+S
k3
EI
+P1
E+P2
E = Enzym, S = Substrat, EI = Acylenzym,
P1 = Amin och P2 = Karboxylsyra
k’1 = apparent första ordningens hastighetskonstant för formationen av P1
k3 = Hastighetskonstanten för formation av P2
Burstfasen är den initiala fasen som
bildas innan jämvikten ställt in sig
ii) Om [S] > [E] samt om förhållandet
mellan k’1 och k3 är stort (i.e. k’1 >> k3)
kommer ”burst-fasen” ha samma
koncentration som [E]0 som då
befinner sig i formen [EI]
Formation av P1 över tid
[P1]
i)
Burst
fas
Tid
Uppkomsten av en burst-fas visar på snabb formation av intermediatet EI
4. Vilka andra händelser (utöver ackumulering av ett intermediat) kan
resultera i en ”burst-fas”? visa med exempel på reaktions scheman
Vi tänker oss följande reaktion som inte innehåller någon intermediär
E+S
Ks
ES
k2
E+P
a) Enzymet kan omvandlas till ett mindre reaktiv tillstånd i kombination
med att det reagerar med de första substratmolekylerna k2 >> k’2
E’+S
K’s
ES
E’S
k2
k’2
Formation av P1 över tid
E’+P Burst fas
[P1]
E+S
Ks
E’+P linjär fas
i)
Burstfas - Snabb produktion av P då en
viss mängd S binder in till allt E
ii) Linjär fas – Långsam produktion av P
vid reaktion med E’
Burst
fas
Tid
b) Dissociering av produkten är hastighetsbegränsande k2 >> k’2
Burstfas bildas från den första mängden S som försvinner eller EP som bildas.
Långsam minskning av S eller ökning av EP fås genom en fördröjning i återanvändningen av E pga
långsam dissociering av EP
ES
k2
EP
k’2
E+P
[S]
[EP]
E+S
Ks
Linjär fas
Burst fas
Burst
fas
Tid
Linjär
fas
Tid
i) Burstfas - Snabb åtgång av S då en viss mängd av S reagerar med allt E till EP
ii) Linjär fas - Långsam åtgång av S som speglar den långsamma återanvändningen av E från EP
iii) Burstfas – Snabb produktion av EP då en viss mängd S reagerar med allt E → EP
iiii) Linjär fas – Långsam produktion av EP som speglar den långsamma återanvändningen av E
från EP
c) Enzymet inhiberas av produkten k2 >> k’2.
Burstfas bildas från den första mängden S som försvinner eller EP som bildas.
På samma sätt som i fallet b fås en långsam minskning av S eller ökning av EP genom en
fördröjning i återanvändningen av E pga inhibering av P.
ES
-P
[S]
E+S
Ks
ES
k2
k2
EP
EP
k’2
k’2
E+P
E+P
[EP]
E+S
Ks
Linjär fas
EP
Burst fas
Burst
fas
Tid
Linjär
fas
Tid
i) Burstfas - Snabb åtgång av S då en viss mängd av S reagerar med allt E till EP
ii) Linjär fas - Långsam åtgång av S som speglar den långsamma återanvändningen av E pga
inhibering av P
iii) Burstfas – Snabb produktion av EP då en viss mängd S reagerar med alle E → EP
iiii) Linjär fas – Långsam produktion av EP som speglar den långsamma återanvändningen av E
pga inhibering av P
5. Visa hur man kan studera k2 genom att a) använda en kromofor som
lämnande grupp, b) använda en kromofor acylgrupp samt c) använda
en kromofor inhibitor till E. Rita grafer!!
Hydrolys av amider och estrar katalyserat av ett serinproteas (kymotrypsin)
Ks
E+S
ES
k2
EI
+P1
k3
E+P2
Villkor mätbetingelser:
i) Enzymet mättas med S ([E] < [S]) vilket ger en ackumulering av ett stabilt
intermediat (EI) över en viss begränsad tid, då det finns tillräckligt med S för att hålla
enzymet mättat ES.
ii) Beräkning av k2 mäts under ”single-turnover” betingelser, ingen återanvändning av
enzymet.
a) kromofor som lämnande grupp:
[P1]
Hastigheten för produktion av acylenzym (EI) bestäms från hastigheten av produktion
av P1 (nitrofenol alt joniserad form av nitrofenol) som absorberar ljus vid en annan
våglängd än esterföreningen.
Ks
E+S
ES
k2
EI
+P1
k3
Linjär fas
E+P2
Exponentiell fas
Tid
i)
Hastighetskonstanten för acylering (k2) samt dissocieringskonstanten (Ks) kan
beräknas från den exponentiella fasens hastighetskonstants beroende av [S].
i)
Olyckligtvis är nitrofenylestrar oftast så reaktiva att acyleringshastigheten är för
hög för att mätas med ”stop flow”
b) Använda en kromofor acylgrupp: Exempelvis furylacryloyl-L-tyrosine etyl ester, vars
spektrum förändas vid inbindning till enzym.
Ks
E+S
ES
k2
EI
+P1
k3
Absorbans
Om absorbansen ökar vid inbindning!
E+P2
Ackumulering av
EI
Produktion av ES
inom dödtid
Tid
i)
Spektrum av furylacryloyl-L-tyrosine etyl ester ändras när det binder till E (i.e. ES)
ii) Spektrum ändras ytterligare vid ackumulering av EI.
iii) Under den exponentiella fasen ackumuleras EI, ger k2.
S,Ks
E
pro
ES
k2
EI
+P1
k3
A465
c) Använda en kromofor inhibitor till E som snabbt kan dissociera från E : Exempelvis
proflavin (pro) - ger en ökning i Abs vi inbindning till E.
E+P2
Dissociering av Epro
Produktion av ES
Beräkning av Ks
Brist på
substrat →
minskning av
EI
(hydrolysen
detekteras)→
ökning av
Epro
Produktion
av EI,
beräkning
av k2
Epro
Tid
Abs konstant tills S är förbrukad
i)
Snabb minskning i Abs får genom snabb dissociering av Epro och snabb formation av ES.
S konkurrerar ut pro.
ii) Exponentiell minskning av Abs fås då EI bildas vilket leder till att mängden fri E som kan
binda till pro minskar. Från dessa fas kan k2 beräknas
iii) Abs är konstant så länge det finns nog med S som försäkrar att E är acylerat (i.e.EI)
iv) Efter en tid stiger abs då S börjar ta slut [EI] minskar och [E] ökar som kan binda till pro.
Ks
E+S
ES
k2
EI
+P1
k3
E+P2
EI
k3
E+P2
pro
Epro
A465
6. Förklara kortfattat hur man kan studera k3
Tid
I.
Man måste först hitta ett substrat som kan bilda EI mkt fort och som kan ackumuleras
som EI dvs all substrat som tillsätts ska först binda till enzymet och bilda EI (k2 >> k3).
Därefter sker en långsam hydrolys under ”singel-turnover” betingelser som detekteras
genom att tillsätta en kromafor-inhibitor som binder in till enzymet då EI övergått till
E + P. Det sker alltså en absorbans-förändring då kromofor-inhibitorn (ex proflavin)
binder till enzymet - denna kurva kan i sin tur relateras till k3.
II. EI kan isoleras genom att förvara den vid ett pH där den är oreaktiv. På så sätt isolerar
man steget man vill studera. k3 kan sedan beräknas genom att vid ett stop-flow-försök
höja pH till reaktiva nivåer och spektroskopiskt mäta hur inbindningen av en kromaforinhibitor till E varierar med tiden.
7. Diskutera värdena på kcat och KM i tabell 7.1 – vilken information kan fås om det hastighetsbegränsade
steget samt förekomsten av ett gemensamt intermediat för olika substrat inom samma klass.
Vid hydrolys av en ester och amider med kymotrypsin bildas ett intermediat (RCO-E)
Acylation
Deacylation
kcat = k2k3/(k2 + k3)
KM = Ksk3/(k2 + k3)
Om flera substrat genererar samma
intermediat och om nedbrytning av
intermediatet är hastighetsbegränsande så
hydrolyseras dessa med samma kcat !!
RCOX
RCOY
RCO-E
kcat
RCO2H+E
RCOZ
• För estrar får samma värde på kcat → Deacylering är hastighetsbegränsande
• k2 >> k3 (kcat = k3) och KM = Ksk3/k2 (Lågt värde på KM - synligt i tabellen)
•För amider är fås ett lågt värde på kcat→ Acyleringssteget är hastighetsbegränsande kcat = k2
• För amider är k2<< k3 och KM = Ks (Högt värde KM- synligt i tabellen)
Den högre reaktiviteten för p-nitrofenylester speglas i ett lägre KM pga k2 ökar vid bättre lämnande grupp
8. Förklara principen för hur fördelning av intermediärer mellan tävlande acceptorer kan visa på
förekomsten av ett gemensamt intermediat.
A
Bestäm fördelningen mellan olika
produkter vid hydrolys av olika
substrat-derivat (i.e. R’ varierar):
E+RCOOR’
RCOA+E
RCO-E
B
RCOB+E
R’-OH
Om produktfördelningen A/B är lika för den enzymkatalyserade reaktionen oavsett egenskap
hos R’ så är detta ett bra bevis för formation av det gemensamma intermediatet RCO-E
Ex kymotrypsin katalyserad
hydrolys av olika estrar i närvaro
av hydroxylamin och vatten
E+RCOOR’
R’
NH2OH
RCO-E
R’-OH
H2O
RCONHOH+E
RCO2H+E
Produktfördelningen är konstant för den enzymkatalyserade reaktionen!
9. Diskutera utifrån figurerna 7.2 och 7.3 hur man kan avgöra om det hastighetsbegränsande steget är
formation eller hydrolys av acylenzyme.
Mät hastigheten för formation av produkt från ett visst
substrat vid olika koncentrationer av acceptor [A]
E+RCOOR’
k2
RCO-E
k3
A
RCOA+E
R’-OH
i) Om det hastighetsbegränsande steget är formation av RCO-E (acylenzym) så kan en
högre koncentration av A inte öka hastigheten för reaktionen då A reagerar med RCO-E
efter det hastighetsbegränsande steget – k2 är hastighetsbegränsande
ii) Om det hastighetsbegränsande steget är hydrolys av RCO-E så leder en högre
koncentration av A till en ökad hastighet för reaktionen – k3 är hastighetsbegränsande
Figure 7.2. Hydrolys av Ac-Phe-TMA = Acetylphenylalanin p-trimetylammoniumanilide
E+Ac-Phe-TMA
Ks
k2
E•Ac-Phe-TMA
Ala-NH2
Ac-Phe-Ala-NH2
Ac-Phe-E
H2O
TMA-OH
Ac-Phe
-Ac-Phe-TMA
kcat (s-1)
i)
Ac-Phe-Ala-NH2
kcat för produktion av Ac-Phe-Ala-NH2 ökar
med ökad [Ala-NH2]
ii) kcat för produktion av Ac-Phe minskar med
ökad [Ala-NH2].
Ac-Phe (hydrolys
med H2O)
iii) kcat för minskning av [Ac-Phe-TMA] är
konstant med ökad [Ala-NH2].
[Ala-NH2] (M)
k2 är hastighetsbegränsande:
Formation av acylenzym är hastighetsbegränsande då ökning av [Ala-NH2]
inte ökar hastigheten för nedbrytning av Ac-Phe-TMA
Figure 7.3. Hydrolys av Ac-Phe-OCH3 = Acetylphenylalanin – metyl ester
E+Ac-Phe-OCH3
Ks
E•Ac-Phe-OCH3
k2
Ala-NH2
Ac-Phe-E
H2O
CH3OH
kcat (s-1)
-Ac-Phe-O-CH3
Ac-Phe-Ala-NH2
Ac-Phe (hydrolys
med H2O)
Ac-Phe-Ala-NH2
Ac-Phe
i) kcat för produktion av Ac-Phe-Ala-NH2
ökar med ökad [Ala-NH2]
ii) kcat för produktion av Ac-Phe minskar
med ökad [Ala-NH2].
iii) kcat för minskning av [Ac-Phe-OCH3]
ökar med ökad [Ala-NH2]
[Ala-NH2] (M)
k3 är hastighetsbegränsande:
Hydrolys av acylenzym är hastighetsbegränsande då ökning av [Ala-NH2] ökar
hastigheten för nedbrytning av Ac-Phe-OCH3
10. Förklara hur man kunnat bevisa reaktionsvägen för reaktionen:
E + ATP + AA + tRNA
E•AA-AMP + tRNA
PPi
AA-tRNA + AMP + E
Till syntes av
proteiner
E = aminoacyl-tRNA synthetase
Nettoreaktion: E kan hydrolysera ATP och bilda komplexet Aminoacyl-tRNA (AA-tRNA)
Hur har man bevisat att reaktionen går via ackumulering av intermediatet E•AA-AMP
(enzymbundet aminoacyl adenylat) och inte via intermediatet E•AA-tRNA
Test för formation av E•AA-AMP:
• Med pyrofosfasutbytes-tekniken:
E+ATP+AA+32PPi
E•AA-AMP+PPi+32PPi
i)
E•AA-AMP+PPi+32PPi
E+32ATP+AA+PPi
I frånvaro av tRNA erhålls en jämn fördelning av isotopinmärkt P i ATP och PPi
ii) Detta kan förklaras av en ständig återanvändning av E•AA-AMP (som attackeras av 32PPi)
iii) Alltså: reaktionen går via formation av komplexet aminoacyl adenylat (E•AA-AMP)
Efter formation av E•AA-AMP sker acyleringen av tRNA
tRNA laddat
med AA
E•AA-AMP
enzymbundet aminoacyl adenylat
Bevis för formation av E•AA-AMP:
i)
Intermediatet (E•AA-AMP) kan isoleras med kromatografi
ii) Fritt aminoacyl adenylat (AA-AMP) har isolerats genom fällning av enzymet med en syra
iii) Det isolerade komplexet kan överföra sin aminosyra till tRNA
iv) Kristallstrukturen av E•AA-AMP har bestämts med tyrosyl-tRNA syntase (E) bundet till
tyrosyladenylat (AA-AMP)
Från ovanstående resonemang är det logiskt att med följande reaktionsmekanism
tRNA
E•AA-AMP
AA-tRNA+AMP+E
E+ATP+AA
PPi
Men trots detta fanns det tveksamheter huruvida E•AA-AMP verkligen ackumulerades under
reaktionen och om det istället inte var så att tRNA reagerade samtidigt som ATP hydrolyserades
enl:
E+ATP+AA+tRNA
E•AA-tRNA
E+AA-tRNA
AMP+PPi
Aminoacyl adenylat mekanismen har bevisats genom ytterligare 2 villkor – studier av IRS
(isoleucyl-tRNA synthetase )
i)
E•AA-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
ii) E•AA-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
i) E•Ile-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
Fig 7.4 Studera reaktionen: E•(14C)Ile-AMP + tRNA → (14C)Ile-tRNA + AMP + E
i)
● (mix av E•(14C)Ile-AMP + tRNA) och ο (mix av E
+ (14C)Ile + ATP + tRNA) ger samma hastighet →
Detta innebär att E•(14C)Ilr-AMP reagerar
tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
ii)
k för överföring av (14C)Ile till tRNA är lika med
kcat för ”steady state” aminoacylering av tRNA
under samma betingelser
iii) Detta innebär att nedbrytning av E•(14C)Ile-AMP
är hastighetsbegränsande (k = kcat)
En logisk reaktionsmekanism är då:
om k > kcat → ett tidigare steg är det
hastighetsbegränsande steget!
om k < kcat → E•AA-AMP kan inte
existera som intermediat då det
reagerar för långsamt!
IRS
Ile
E+ATP+AA
tRNA
E•AA-AMP
AA-tRNA+AMP+E
PPi
k
ii) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
Figur 7.5 - Då man mixar IRS + (γ-32P)ATP + Ile + tRNA fås en burstfas från produktion av 32PPi
i) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
Detta är förenligt med reaktionsmekanismen:
slow
fast
E+ATP+AA+tRNA
E•AA-AMP+tRNA
AA-tRNA+AMP+E
PPi
Eller med reaktionsmekanismen:
Två olika intermediat
slow
fast
E+ATP+AA+tRNA
E•AA-tRNA
E+AA-tRNA
AMP+PPi
Den senare reaktionsmekanismen kan motbevisas:
i) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
Figur 7.6: Då man mixar IRS + ATP + (14C)AA + tRNA fås inte någon burstfas som
skulle kunna visa på snabb produktion av E•(14C)AA-tRNA
Alltså gäller:
slow
fast
E+ATP+AA+tRNA
E•AA-AMP+tRNA
AA-tRNA+AMP+E
PPi
10. Förklara och diskutera hur man mha ”rapid quenching experiments”
kommit fram till att editeringsmekanismen för bortstötning av felplacerad
threonin involverar en felkoppling av Thr till tRNAVal följt av en snabb hydrolys.
Proofreading vid proteinbiosyntes kan bero på:
i) Hydrolys av felaktigt komplex E•AA-AMP (amino acyl komplex) av E (aminoacyl-tRNA
synthetase)
E+ATP+AA+tRNA
Hydrolys
E+AA+AMP+tRNA
E•AA-AMP+tRNA
PPi
ii) Hydrolys av ”mischarged” AA-tRNA
E+ATP+AA+tRNA
E•AA-AMP+tRNA
PPi
AA-tRNA+AMP+E
Hydrolys
AA+tRNA+AMP+E
i) Argument för formation av det felaktiga komplexet VRS•Thr-AMP:
VRS = Valyl-tRNA synthetase
Pyrofosfatutbytestekniken:
VRS + ATP + Thr + 32PPi
VRS•Thr-AMP + PPi + 32PPi
32P
VRS•Thr-AMP + PPi + 32PPi
VRS + 32ATP + Thr + PPi osv
blir jämt fördelad mellan ATP och PPi
Detta kan förklaras av en ständig återanvändning av VRS•Thr-AMP som
kan attackeras av PPi
VRS katalyserar 32PPi utbyte i närvaro av threonin och bildar
komplexet VRS•Thr-AMP i frånvaro av tRNA
ii) Argument för formation av VRS•Thr-AMP samt hydrolysering av
”mischarged” Thr-tRNAVal:
I närvaro av tRNA och Thr verkar VRS som ett ATP fosfatase och hydrolyserar ATP →
AMP + PPi och katalyserar inte en nettoformation av Thr-tRNAVal.
VRS+ATP+Thr+tRNAVal
VRS•Thr-AMP+tRNAVal
PPi
VRS+Thr-tRNAVal
VRS+Thr+tRNAVal
AMP
Nettoreaktionen blir hydrolys av ATP → PPi + AMP
Under den här reaktionen formas intermediatet VRS•Thr-AMP
(som visas genom 32PPi utbytesreaktionen) men även
intermediatet Thr-tRNAVal måste bildas och hydrolyseras
iii) Argument för formation av ”mischarge” Thr-tRNAVal
Transient ”mischarged” tRNAVal kan detekteras och isolerats
Figur 7.7: Blanda VRS•(14C)Thr-AMP + tRNAVal → (14C)Thr- tRNAVal (transiently formed)
(14C)Thr- tRNAVal kan isoleras
genom fällning med fenol
iiii) Hydrolys av ”mischarge” Thr-tRNAVal mha VRS sker tillräckligt snabbt för att
vara ”on pathway”
Figur 7.8: (14C)Thr-tRNAVal + VRS → (14C)Thr + tRNAVal, k = 40 s-1
iiiii) Produktion av Thr-tRNAval är tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”
Figur 7.9: VRS•Thr-32AMP + tRNAVal → VRS + Thr-tRNAVal + 32AMP, k = 36 s-1
Alltså är det följande reaktionsmekanism som gäller:
k=36s-1
VRS+ATP+Thr+tRNAVal
VRS•Thr-AMP+tRNAVal
PPi
VRS+Thr-tRNAVal
AMP
k=40s-1
VRS+Thr+tRNAVal

similar documents