AMPs - e-learning

Report
Il compartimento naturale dell’immunità
innata: i peptidi cationici antimicrobici
(AMPs)
Dr. Luigi Lembo Fazio
Sapienza Università di Roma
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin”
Peptidi cationici antimicrobici (AMPs)
1. I piccoli peptidi antimicrobici (AMPs) possono considerarsi
come antibiotici naturali con attività microbicida ad ampio
raggio contro batteri Gram positivi e negativi (talvolta anche
contro funghi e virus)
2. Questi antibiotici naturali sono effettori ancestrali del sistema
immunitario innato e come tali sono stati descritti in un’ampia
varietà di specie appartenenti a Piante, Insetti, Anfibi e
Mammiferi
3. Svolgono un ruolo essenziale nel compartimento naturale
dell’imunità innata e soprattutto a livello delle superfici
mucosali (epitelio del tratto respiratorio, della pelle e del tratto
gastro-enterico)
I peptidi antimicrobici: le Defensine [1]
• Le defensine sono una classe di peptidi con attività battericida (AMPs
antimicrobial peptides) verso un largo spettro di patogeni Gram-positivi e
negativi
• Il termine è stato inizialmente coniato da Ganz (1985) per descrivere tre
piccoli peptidi con attività antibatterica isolati da una specifica popolazione
cellulare, i neutrofili.
• Da un punto di vista strutturale le defensine si possono descrivere come
piccoli peptidi (18-45 aa), cationici, caratterizzati da 3 legami disolfuro
intramolecolari che coinvolgono 6 residui conservati di cisteina.
•Sono generalmente prodotte come precursori inattivi: la maturazione richiede
un processamento proteolitico.
• Le defensine sono raggruppate in tre principali famiglie di proteine: le a, le b e
le -defensine
• L’espressione e il rilascio delle defensine e conseguentemente la distribuzione
di questi AMP sono differentemente regolati a seconda del tipo di defensina, del
tipo cellulare e dello specifico microambiente
Le Defensine [2]
 Le defensine sono piccoli peptidi di circa 2-3
kDa
 Mostrano una conservazione nella struttura
tridimensionale: residui idrofobici e residui
carichi positivamente
Salzman et al., Seminars in Immunology 19 (2007); Koprivnjak AND Peschel, Cell. Mol. Life Sci. 2011
Le Defensine nel tratto gastro-enterico
• La fonte principale di produzione delle a-defensine nel tratto gastro-intestinale
sono cellule specializzate, indicate come cellule del Paneth, localizzate a livello
delle cripte, nel piccolo intestino
• Nell’uomo ma non nel topo le a-defensine sono prodotte anche dai neutrofili
• L’espressione delle a-defensine nelle cellule del Paneth sembra essere
largamente costitutiva ed è parte integrante del processo di differenziazione di
questa popolazione cellulare
• Le b-defensine sono prodotte da diversi tipi di cellule epiteliali (ivi compresi i
colonociti)
• Con l’eccezione della HBD1 la cui espressione sembra essere costitutiva, le bdefensine del tratto gastro-intestinale sembra essere indotta in seguito a fenomeni
infettivi/infiammatori
Le Defensine [3]
Le cellule del Paneth sono cellule epiteliali con caratteristiche tipiche di cellule
secretorie (apparato del Golgi e reticolo endoplasmatico molto ben sviluppato)
Sono localizzate nel piccolo intestino alla base delle cripte del Lieberkuhn
Bevine AND Salzman, 2011, Nat. Rev. Microbiol.; Salzman et al., 2007, Seminar in Immunol
La famiglia Reg dei peptidi antimicrobici
• Appartengono alla superfamiglia delle C-type lectins
• Reg3g (nel topo) e Reg3a (nell’uomo) sono i membri meglio caratterizzati
• Sono proteine di circa 15 kDa espresse nel piccolo intestino
• Vengono prodotte nel largo intestino nel corso di un’infezione batterica o in
condizioni di infiammazione
• Come tutti i membri di questa superfamiglia possiedono un dominio lectinico in
grado di legare lo scheletro saccaridico del peptidoglicano (PGN)
• A differenza delle defensine, mostrano una specificità di attività microbicida nei
confronti dei batteri Gram positivi
• Reg3g viene co-espresso con una seconda molecola, Reg3b (anch’esso in grado
di legare il PGN). La funzione microbicida di Reg3b non è stata tuttavia ancora
dimostrata
Gallo AND Hooper 2012, Nat. Rev. Immunol.
Peptidi antimicrobici della pelle
Gallo AND Hooper 2012, Nat. Rev. Immunol.
Le Catelecidine [1]
1.
Nell’uomo esiste un solo gene sul cromosoma 3, il gene CAMP
(catelecidin-antimicrobial peptide) codificante un precursore inattivo
2.
Precursore inattivo: precursore della catelecidina o hCAP18 (human
cationic antimicrobial peptide 18) con lunghezza di 170 aa
3.
Inizialmente identificata nei precursori mieloidi e nei cheratinociti durante
processi infiammatori/infettivi
4.
È prodotta principalmente da cellule mieloidi, neutrofili, mast cells,
monociti (immagazzinamento in granuli) e cheratinociti
5.
Cellule epiteliali del tratto respiratorio, uro-genitale e gastro-enterico
(colonociti) rappresentano anche fonti di produzione della catelecidina
AMPs: meccanismo d’azione
 Molti AMPs hanno come bersaglio strutture essenziali alla
sopravvivenza dei microrganismi
 Alcuni AMPs hanno attività enzimatica (lisozima, sPLA2)
 Altri AMPs portano al killing della cellula microbica attraverso
meccanismi NON enzimatici
 Per molti altri il meccanismo d’azione non è stato ancora
chiarito:
- ANG4 (RNA-asi prodotta dalle cellule del Paneth)
- Reg3g
Alcuni AMPs hanno attività battericida ma questa non interviene
direttamente nella distruzione delle membrane:
- Calprotectina, psoriasina, dermicidina
La calprotectina è un chelante di ioni Zn2+ e Mn2+
AMPs: la modellizzazione
Worm-hole model
Helical bundle model
AMPs e la modulazione della risposta immunità
 Molti AMPs agiscono come effettori dell’immunità innata
attraverso meccanismi che non sono strettamente correlati alla loro
attività microbicida
 Gli AMPs possono considerarsi come immuno-modulatori:
1. Segnalazione attraverso recettori per citochine/chemochine
2. Segnalazione attraverso i TLRs (TLR9-LL37 e pDCs)
3. Segnalazione attraverso recettori per fattori di crescita
(catelecidine)
Le catelecidine come immunomodulatori
AMPs: attività chemotattica
 L’azione chemotattica può essere diretta o indiretta
 L’LL37 promuove il reclutamento di neutrofili, monociti e linfociti T
 Questa attività viene regolata attraverso il recettore FPRL1 (G-protein-coupled
formyl peptide receptor like1)
 HNP1, HNP2, BD3 e BD4 esercitano attività chemotattica su monociti e
macrofagi
 BD2 e LL37 promuovo il reclutamento dei mastociti
 In alcuni casi l’attività chemotattica sembra essere unica e specifica:
- le a-defensine inducono il reclutamento dei linfotici T
naive CD4+CD45RA+ e dei linfociti CD8+ ma non dei T memoria
CD4+CD45RO+
- le b-defensine inducono il reclutamento dei linfociti T memoria
CD4+CD45RO+ e delle iDCs
Questo effetto delle defensine umane viene inibito in presenza di anticorpi
diretti contro il recettore CCR6
Il caso curioso della papiliocina di Papilio xuthus
Il caso curioso della papiliocina di Papilio xuthus
I peptidi antimicrobici: la regolazione
• L’espressione, la secrezione e l’attività dei AMPs è finemente
regolata:
1. Regolazione trascrizionale (dipendente o indipendente
dal microbiota)
2. Regolazione durante lo sviluppo
3. Regolazione post-traduzionale
4. Regolazione della secrezione
5. Regolazione durante un danno dell’epitelio
AMPs: la regolazione trascrizionale
Sono cellule che
risiedono nella LP e
hanno caratteristiche
delle NK
Gallo AND Hooper 2012, Nat. Rev. Immunol.
AMPs: la regolazione trascrizionale
Effetto diretto nella
regolazione
trascrizionale delle bdefensine dopo stimolazione
del TLR2
Effetto indiretto nella
regolazione
trascrizionale delle
catelecidine
Gallo AND Hooper 2012, Nat. Rev. Immunol.
AMPs: la regolazione durante lo sviluppo
• L’espressione di ANG4 e Reg3g è indotta rapidamente nei primi
giorni dopo la nascita e aumentano notevolmente (3000 volte per
Reg3g) durante la vita adulta
• La catelecidina LL37 ha un andamento opposto e nella vita adulta
la sua espressione si mantiente elevata solo nel colon ma tende a
scomparire nel piccolo intestino
Salzman et al., 2007, Seminar in Immunol
AMPs: la regolazione post-traduzionale
• L’attività delle a-defensine è finemente regolata:
1. Immagazzinamento in granuli secretori
2. Processamento proteolitico
•Le a-defensine delle cellule del Paneth sono presenti in forma di
precursori (90-100 aa). La maturazione è un processo a due steps
che richiede:
- Rimozione della sequenza segnale all’N-terminale
- Processamento proteolitico ad opera di un’endopeptidasi
(tripsina nel caso dell’uomo, MMP7 nel topo)
• Similmente anche le lectine Reg3 necessitano di un
processamento proteolitico all’N-terminale che avviene sia nel topo
che nell’uomo ad opera della tripsina, una volta che le molecole
sono state secrete nel lumen intestinale.
AMPs: la regolazione post-traduzionale
AMPs: la regolazione della secrezione
• Nel piccolo intestino la secrezione dei AMPs ad opera delle
cellule del Paneth avviene in risposta a stimoli microbici (LPS)
• Analogamente, a livello della superficie epidermica, le ghiandole
eccrine, apocrine e sebacee rispondono a specifici PAMPs o
DAMPs
• I meccanismi attraverso i quali si realizzano questi check-points
non sono ancora stati identificati
AMPs: la regolazione durante un processo
infiammatorio/infettivo
• L’espressione della BD3 viene
indotta in seguito alla stimolazione
di recettori per fattori di crescita
importanti per il riparo tissutale
(EGFR)
• il gene CAMP è sotto il controllo
trascrizionale di elementi di
risposta alla vitamina D3 (VDRE).
In seguito a danno tissutale, la
vitamina D3 viene idrossilata e in
questa
forma
promuove
la
trascrizione della catelecidina
• Coinvolgimento del TLR2 e/o
stimolazione di recettori per le
citochine
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Protezione contro i patogeni
 Le prime evidenze sperimentali vengono dallo studio di topi
Mmp7-/- Maggiore suscettibilità al challenge con S. enterica
sereovar Thyphimurium
 Topi KO per le catelecidine: maggiore suscettibilità a infezione ad
opera di Streptococchi, vaccinia virus e Leishmania
 Utilizzo di topi transgenici DEFA5
Salzman et al., 2007, Seminar in Immunol
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Salzman et al., 2007, Seminar in Immunol
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Salzman et al., 2010, Nat. Immunol.
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Salzman et al., 2010, Nat. Immunol.
SFB: Segmented filamentous bacteria
 Candidatus arthromitis
 Batterio non coltivabile, gram positivo appartenente al Phylum dei
Firmicutes, sporigeno
Particolarmente sensibile al trattamento con antibiotici
SFB e differenziazione dei linfociti Th17
 I linfociti Th17 nella lamina propria inducono l’espressione di peptidi
antimicrobici , principalmente di Reg3g
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Regolano la composizione del microbiota
Salzman et al., 2010, Nat. Immunol
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Regolano la composizione del microbiota
Salzman et al., 2010, Nat. Immunol; Bevins AND Salzman, 2011, Nat. Rev. Microbiol.
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Regolano/limitano il contatto cellula epitelia-batteri
Studio della composizione microbica in topi Reg3g-/Aumento dei batteri Gram positivi che colonizzano la superficie epiteliale
(SFB)
 Questa situazione non si estende alle comunità batteriche residenti nella
porzione luminale del muco
AMPs: le defensine e il loro ruolo in vivo
Ricapitolando….
Meccanismi di resistenza dei patogeni
1.
Produzione di molecole che inattivano i peptidi antimicrobici
2.
Modificazione delle strutture di superficie
- Sintesi di esopolisaccaridi
- Modificazioni della carica (acidi teicoci, modificazioni del lipide A)
- Cambiamento della fluidità delle membrane
3.
Espulsione dei peptidi antimicrobici mediante meccanismi di pompe ad
efflusso
Meccanismi di resistenza dei patogeni [1]
1.
S. aureus: produzione della stafilochinasi in grado di legare e prevenire
l’attività dei peptidi antimicrobici
2.
La stafilochinasi forma complessi con specifiche a-defensine (HNP1-3):
riduzione di circa l’80% dell’attività microbicida
3.
S. pyogenes (gruppoA): la proteina Sic (inibitore del complemento) ha un
meccanismo d’azione simile alla stafilochinasi
4.
Diversi patogeni producono molecole in grado di tagliare e quindi inattivare i
peptidi antimicrobici (aureolisina di S. aureus, ZapA di Proteus mirabilis,
elastasi di P. aeruginosa, streptopaina SpeB di S. pyogenes)
5.
L. mocytogenes: N-deacetilazione del peptidoglicano (PGN), correlata con il
mancato “sensing” ad opera dei recettori Nod1 e Nod2
Meccanismi di resistenza dei patogeni [2]
1.
L. mocytogenes: N-deacetilazione del peptidoglicano (PGN), correlata con il
mancato “sensing” ad opera dei recettori Nod1 e Nod2
2.
Modificazione del lipide A nei batteri Gram negativi:
1. Sostituzione dei gruppi fosforici con gruppi fosforil-etanolamminici,
con residui saccaridici (arabinomannani, acido glucuronico)
3.
Modificazioni a carico del core e dell’antigene somatico degli LPS
Meccanismi di resistenza dei patogeni [3]
4.
D-Alanilazione degli acidi teicoici (TA)
•
S. aureus, Enterococcus, L. monocytogenes, Bacillus spp.
•
Presenza di un operone dltABC
•
Fattori ambientali, quali pH, osmolarità, temperatura promuovono
l’attivazione dell’operone
Meccanismi di resistenza dei patogeni [3]
5.
L-lisinilazione del fosfatidilglicerolo, PG (fosfolipidi di membrana)
•
La sintesi di un PG modificato con lisina avviene ad opera della proteina
MprF (97 kDa)
•
Proteina con due domini funzionali: C-terminale responsabile della sintesi del
PG-lisinato e un dominio N-terminale di flippaggio
•
Mutanti mprF: aumentata sensibilità agli AMPs, maggiore suscettibilità al
killing da parte dei neutrofili, attenuati in modelli animali

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