期末實驗報告

Report
Molecular Biology Presentation
生醫三
Group 13
992334 林思慧
992339 黃珮瑄
LB plate
Negative control
Ligation 13-1
Positive control
Ligation 13-2
2
Plasmid DNA
13
M
P
L1
L2
13*
P*
L1*
L2* 13
P
L1
L2
13*
P*
L1*
L2*
8.0 kb
3.0 kb
1.0 kb
0.5 kb
M:marker Black:person 1 (思慧)
L:ligation Blue:person 2 (珮瑄)
P:positive * : treated with restriction enzyme
3
Discussion
• 塗菌的時候沒有塗均勻,colonies沒有分散,挑
菌的時候不易找到單一的菌落。
• 塗菌時取的菌液量(300μl)太多,菌長得很密。
• 跑DNA電泳時,因為在load DNA不小心太快,部分
DNA會被沖到well外,使得跑出來的兩組band亮度
稍微不同。
4
Summary
• 塗盤
– Negative control知道Ampicillin有效抑制雜菌生長
– Positive control中攜帶抗Amp gene的細菌能夠生長
– Ligation的LB plate上都是攜帶抗Amp gene的DH5α菌株
• DNA電泳
– 經酵素切過後,ligation1&2在1kb的位置都有跑出band,
即transformation有成功將帶有DNA片段的vector轉入
DH5α菌株中。
5
SDS-PAGE (CBR)
GST
Purification
GST-D
IPTG
M
-
+
-
-
No Purification
+ -
+ -
+
+ -
75kDa
+
28kDa
- : No Purification
+ : Purification
6
PVDF membrane (Antibodies)
Purification
No Purification
M
75kDa
28kDa
7
PVDF membrane (CBR)
Purification
No Purification
M
75kDa
28kDa
8
Discussion
• 在封膠的時候有小泡泡,所以膠有龜裂的現象
• 可能配膠時沒有做好,所以不管是maRker還是蛋白
跑的結果中會看到糊掉的maRker或染出直線狀痕跡
• Transfer過程沒有完全趕掉泡泡,阻擋protein與
PVDF結合,但是在這裡不影響實驗結果的觀察
• 可能Transfer到PVDF membrane上的蛋白量很少,
或者抗體作用不完全,導致免疫染色的結果不佳
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Summary
• 經過IPTG誘導基因表達並加以純化,western
blot結果在~28kDa有大量蛋白的表現。
• 由PVDF membrane上的CBR檢測結果可知PVDF
membrane上是有蛋白成功transferred。利用免疫
染色更容易探討單一個蛋白的表現。這個部分實
驗可以再次做確認。
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References
• 慧眾生物科技有限公司-1kb DNA Ladder DL1000
http://www.bioman.com.tw/pr_cont.asp?id=3&myar
ea=1
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