Mort cellulaire

Report
La Mort Cellulaire
en Radiothérapie
C. HENNEQUIN,
Hôpital Saint-Louis, Paris
S. RIVERA
Gustave Roussy, Villejuif
Mort cellulaire:
Définition
Mort cellulaire ou mort clonogénique:
perte de la capacité proliférative
Effet recherché en radiothérapie
Tests clonogéniques
Mort cellulaire
1/ Cellules proliférantes
 perte de la capacité de prolifération
Intérêt dans le traitement du cancer
Disparition des cellules clonogéniques
2/ Cellules différenciées
Cellules nerveuses, musculaires, secrétoires, …
 Perte de la fonction
Tissus sains +++ Toxicité
Cell response to ionizing radiation
IR
DNA double strand
break induction
• Hypoxia
• Free radical scavengers
• Chromatin structure
• Cell cycle arrest
to allow repair
DNA double strand
break repair
Tolerance of
residual damage
• Repair enzymes
- production in
response to damage
- rate and accuracy
of repair
Cell lives
Cell death
Cell dies
Effets cellulaires des radiations ionisantes
-Formation de lésions sur l’ADN
- Activation de voies de signalisation
=> Expression génique modifiée
=> Synthèse/dégradation protéique
- Mutations/ aberrations chromosomiques
- Altération de la progression du cycle cellulaire
- Modifications du phénotype
- Mort cellulaire
Types de lésions crées

Lésions létales:
Ne peuvent pas être réparées
Entraînent la mort cellulaire rapide

Lésions potentiellement létales (PLD)
> Peuvent être réparées si les caractéristiques
Du milieu s’y prêtent

Lésions sublétales (SLD):
> Peuvent être réparées si on leur laisse le temps
Concept de SLD
Lésion sub létale

Lésion potentiellement réparables si on laisse le
temps aux réparations d’avoir lieu
Fraction
Survivante
Temps de réparation
Variable d’un tissu à
l’autre
1
2
3
4
5
Heures
Délai entre deux fractions
Evènements conduisant à la Mort cellulaire radio-induite
Réparation ad integrum
RI
Phase
cycle
Temps
Réparation
Défauts de réparation
P
p53
Chromosomes
p21Waf1
Sénescence
Translocations
Inversions
Capture télomères
Délétions
Acentriques
Dicentriques
Cassures
Apoptose
Oncose (nécrose)
Mort différée
Instabilité génomique
Autres???
Les différents types de mort cellulaire
Mort
immédiate
Senescence
Mort mitotique
Apoptose
Non
programmée
Programmée
Non programmée
Programmée
Cellules
épithéliales
Fibroblastes
Cell. Épithéliales
Mutations/délétions
pT53
Lymphocytes
Thymocytes
Prostate
Acini salivaires
Cryptes intestinales
Cell. endothéliales
Oncose (nécrose)
Mort différée
Mort immédiate
Survient quelques minutes/heures après l’irradiation
Forte dose de rayonnement
Hyperactivation de la PARP
Perte de l’intégrité membranaire, activation des lysosomes,
Dégradation rapide des organites intra-cellulaires
Sénescence/ Quiescence ou arrêt en G1
Arrêt en G1 irréversible : fibroblastes
Disparition complète des cyclines
et perte irréversible du pouvoir de prolifération
« Dose unique de 40 à 60 Gy »
Fibroblastes métaboliquement actifs pdt de longues durées,
(utilisés en cocultures comme supports)
Fibroblastes en culture
Les cell. Jeunes sont petites
et fixent peu la b-Galactosidase.
Les cell. agées sont grandes,
Multinuclées
et positives pour la b-galactosidase
Sénescence
 Perte définitive de la capacité de prolifération tumorale
 Mise en évidence par:
 secrétion accrue de b-galactosidase
 foci d’hétéro-chromatine spécifique
 Impliquée dans les effets de la RT sur les cellules prostatiques
Voie métabolique:
DNA damage ----> p53 ----> p21 ----> Arrêt du cycle cellulaire
Pas de sénescence chez les P53 mutées!
Autophagie
Processus de digestion cellulaire
Dégradation lysosomale des protéines et organites
Création d’un autophagosome au sein de la cellule
contenant protéines/organites
puis fusionnant avec les lysosomes
Régulé génétiquement
autophagy-related genes
Mécanismes de mort des cellules
cancéreuses
Mort cellulaire autophagique
Mort cellulaire de type 2
La mort cellulaire par autophagie
Mort cellulaire
 Mécanismes principaux:
 Mort mitotique et Nécrose (Oncose)
 Apoptose
 Necrose et mort mitotique
 Survienent quand des lésions non réparées débouchent
sur des aberrations chromosomiques
(dicentriques, acentriques, …)
Aux mitoses suivantes, ces aberrations conduisent
À des « catastrophes mitotiques »
Mécanismes de mort des cellules
cancéreuses
Mort cellulaire autophagique
Mort cellulaire de type 2
Nécrose
Mort cellulaire de type 3
La mort cellulaire par catastrophe
mitotique
Divisions cellulaires
asymétriques
Mort mitotique
• Aberrations chromosomiques graves:
- Non transmises à la descendance
- Conduisent à la mort cellulaire rapide
• Aberrations « bénignes »
(translocations, inversions, courtes délétions)
• Compatibles avec une survie clonogénique
• Mais instabilité génomique/chromosomique
• Responsables d’une mort cellulaire future
• Faible potentiel clonogénique => microcolonies
Mort mitotique différée
Après irradiation,
Les cellules finissent par mourir
mais après un nombre variable de divisions (jusqu’à 20)
(Thompson, IJRB, 1969)
Mort mitotique différée
• Secondaire à des aberrations chromosomiques transmises
Réarrangements complexes/dicentriques:
Diminution de 30% et 50% à chaque mitose
• Ou acquises après quelques divisions (Instabilité génomique)
Augmentation de la fréquence des mutations de novo,
des aberrations chromosomiques, et de la létalité
 Diminution de la capacité proliférative (Plating efficiency)
des cellules irradiées
De 15 à 20% par passage
(Little, IJRB, 1990; Motherhill, IJRB, 1997; Hendry, Radioth. Oncol, 2001)
Mort mitotique
• Incapacité à accomplir avec succés une mitose,
• Conséquence de l’accumulation
de lésions chromosomiques non réparées
• Apparition de cellules binuclées et géantes,
et de micronoyaux
• Mort cellulaire prépondérante ds les cell. Épithéliales
• Peut déboucher sur nécrose (oncose) ou apoptose
Nécrose (Oncose)
Reproductive cell death
-Caractérisée par sa spécificité pour les cell. proliférantes
- Augmentation de la perméabilité membranaire
- Diminution rapide des synthèses protéiques
- gonflement des mitochondries, puis de la cellule
-Corrélation entre oncose et:
- quantité de lésions crées sur l’ADN
- aberrations chromosomiques (Ward, IJRB, 1990)
Incapacité pour la cell. à réparer complétement et
correctement les lésions de l’ADN
Anomalies biochimiques/métaboliques
-Se traduit par un épaulement de la courbe de survie
(lésions toxiques potentiellement réparables)
NECROSE
• Gonflement du cytoplasme et des organites
• Accroissement de la perméabilité membranaire
(entrée des colorants: éosinophilie)
• Condensation puis lyse chromatinienne
sans oligomères de nucléosomes
• Perte des organites cellulaires et vacuolisation
• Infiltration par des cell. inflammatoires
Kerr, 1965: Observations morphologiques
La mort cellulaire par nécrose
Nécrose cellulaire
V79 irradiés à la dose de 5 Gy après 7 jours
A: colonie normale
B,C: colonies irradiées
Apoptose
Décrit initialement comme une mort en Interphase
(ne nécessitant pas de mitoses)
Décrite chez les lymphocytes, les cell. Seminomateuses
et les ovocytes
Processus actif, necessitant la synthèse de nbres protéines
Mort programmée
Evenements déclenchant
l'apoptose
- selon les types cellulaires
• Différenciation cellulaire lors du dévellopement
• Suppression hormonale ou de facteurs de croissance
• Signal de mort (récepteur FasAPO-1/CD95 des lymphocytes)
• TGF-ß, TNF, corticoïdes, …
• Perte d’adhésion (anoikis)
• DNA-damaging agents: Drogues, toxines, Rayons X, …
Apoptosis
Apoptotic signals
Initiator caspases
Coactivators
Inhibitors
Effector caspases
Biochimie de l'apoptose:
Activation des Endonucléases
• Endonucléases: coupent l'ADN entre les nucléosomes
=> fragments mutiples de 185 bp
=> "Apoptotic ladder" sur gel d'agarose
• Reconnaissance topologique et non d'une séquence d'ADN
• Activation:
- endonucléases DNAse I et II
- NUC-18 (Thymocytes)
Apoptose: vue générale
Voie extrinséque
Voie intrinséque
TNF-related proteins
- GF withdrawal
- X-rays, Chemo
Caspase activators
Death effectors:
FADD, TRADD
Cytochrome C
Release
Initiator caspases
Caspases 8, (10)
Apaf-1
Caspase 9
Signals
Caspases 3, (6-7)
Effector caspases
APOPTOSE
Voie intrinséque
Cytotoxic
signals
Bcl2
Bax
Apoptosome
CytochromeC
Apaf-1
Caspase 9
IAPs
Caspase 3
Diablo
IAPs: Inhibiteurs de l’apoptose
La mort cellulaire par apoptose
Apoptose radio-induite
 Survient classiquement dans les 48 hr suivant RT
 avant la mitose
 mort en interphase (Stephens, Rad Res, 1991)
 déclenchée par les DSB (Story, IJRB, 1994)
DNA damage
Radiation sensors
P53 activation
Signal transduction
P21; Rb
Mdm2
Gadd45
Caspases
Bax
Fas
Growth arrest
Apoptosis
Apoptose Radio-Induite
- Requiert la p53 (+++)
(Kastan, Cancer Res., 1991; Kuerbitz, PNAS, 1992)
Thymocytes des souris p53 -/-: pas d’apoptose radio-induite
(Clarke, Nature, 1993; Lowen, Blood, 1993; Lowe, Nature, 1993)
Cell. Cryptiques intestinales: souris Nles: apoptose
souris p53 -/-: pas d’apoptose
(Clarke, Oncogene, 1994)
- L’irradiation accroît l’activité p53 cellulaire
( Zhan, Mol Cell Biol, 1993)
- Les cellules p53 mutées seraient donc plus radio-résistantes
(Lowe, Science, 1994)
p53 status and the Efficacy
of Cancer Therapy In Vivo
Lowe, Science, 1994
Fibrosarcoma cell lines p53 +/+ or p53 -/Injected in nude mices
Irradiation (7Gy oy 14 Gy) or Adriamycin treatment
Death by apoptosis after irradiation or chemotherapy
p53 +/+
7 Gy
p53 -/-
14 Gy
Adria
Lowe,
Science, 1994
Radiation-induced apoptosis
p53
Bax (Noxa)
Bcl2
Relarguage du cytochrome C
des mitochondries
Apaf-1/casp-9
DNA damage outcomes
ATM
DNA-PK
DNA-DSB
(p450, Ku 70/86)
p53
p21
G2/S/G1 delay
Repair
Bax
Bcl2
Apoptosis
Reproductive integrity
P53 au centre de la réponse aux
dommages radio-induits
P53: gardien du génome
P53:
Acteur direct de la réponse aux lésions de l’ADN
Liaison aux protéines
XPD, XPB et CSB (Hélicases)
Du Nucléotide-excision repair (NER)
(Wang, Nature Genet, 1995;
Leveillard, EMBO J, 1996)
Liaison aux Hélicases:
WRN: Sdr de Werner
BLM: Sdr de Bloom
RECQ4: Sdr de
Rothmund-Thomson
Facilite la « base excision repair »
(Offer, FEBS Lett., 1999)
Action directe de la P53
sur la réparation des DSBs
Réparation des DSBs
Selon le statut p53
(Test de la comète en haut
Et Foci H2AX en bas)
Lignée HCT116 wP53
carrés noirs
Ou déficiente en p53
carrés blancs
Mirzayans, IJROBP, 2006
Role de Bax
dans l’apoptose radio-induite
-Augmentation p53 dépendante de Bax après RT
Démontrée dans plusieurs lignées cellulaires
-Mais:
- Induction d’Apoptose par p53
observée sans augmentation de Bax
- Les souris Bax -/ont une apoptose p53 dépendante post-RT nle
Quatre voies apoptotiques

P53 --> BAX ---> Voie intrinsèque
 DNA damage ---> Ceramide synthase ---> Voie
intrinséque
 Atteinte membranaire
> ---> activation de la sphingomyélinase
> ---> transformation de la sphingomyéline en céramide
> ---> activation de la voie intrinséque

Activation de la voie extrinséque
Target for Radiation-induced Apoptosis:
The plasma membrane ?
Activation directe
RT
de la sphingomyelinase membranaire
Ceramide
Sphingomyelin
Voie métabolique
Du stress
Apoptose
(Santana, Cell, 1996
Chumura, Cancer Res, 1997)
Quatre voies apoptotiques
Sphingomyelinase
Ceramide
Ceramide
synthase
DNA
damage
p53
Fas
Bax
Apoptose
Death
Receptor
Caspase 8
Apoptose et Réponse à l’irradiation
 Importance du phénoméne apoptotique après irradiation ?
• Dépend des tissus étudiés
• Très variable d’une tumeur à l’autre
• par ex., les fibroblastes ne meurent pas d’apoptose
(Yanagihara, IJRB, 1995)
• alors que c’est le principal mode de mort
des cell hématopoïétiques
L’induction d’apoptose semble corrélée au contrôle tumoral
Dans certaines lignées, pas de corrélation
entre apoptose radio-induite et survie cellulaire
(Alridge, Br J Cancer, 1995)
Comparison
of apoptotic
response
in 15 different
tumours
Apoptose et irradiation fractionnée
Chen, Rad Res, 1994 -
Rat embryo cells
A 2 Gy:
- Survie avec apoptose: 0.53
- Survie sans apoptose: 0.67
Apres
32 fractions
- Survie avec apoptose: 1.5.10-9
- Survie sans apoptose: 2.7.10-6
=> Prob. de contrôle local diminuée de 30%
Apoptose spontanée
dans les tumeurs
- Rare
- Dans le cancer du col utérin:
Entre 0 et 4% des cellules
(Levine, Lancet, 1994, 344: 472)
-Facteur pronostique avant radiothérapie ?
=> Données contradictoires
Nouvelles hypothéses
La cible: l ’ADN
La cible: membrane/cytoplasme
Bystander effect
Entose ou cannibalisme cellulaire
Post-Doc2
Overholtzer et al. Cell.
2007.
 Mort cellulaire non apoptotique
 Internalisation d’une cellule vivante dans une cellule vivante
 Elimination de la cellule internalisée par les lysosomes de la cellule hôte
Cannibalisme cellulaire dans les tumeurs
Post-Doc2
Pleural effusion
b-cat
MUC-1
Breast tumor
Melanoma
b-cat
b-cat
Cytokeratin 5
Cano et al, EMBO Molecular Medicine
(2012)
Florey et al, Nature Cell Biology (2011)
Krajcovic et al, Nature Cell Biology (2011)
Guadamillas, Journal of Cell Science (2011)
Yuan, et al, Genes and Development (2010)
Wang et al, Cell Research (2009)
Overholtzer et al, Cell (2007)
White et al, Cell (2007)
Conclusion: mort cellulaire en
radiobiologie



= Perte de la capacité de division et non
disparition physique de la cellule!!!
Une cellule morte peut métaboliser
La létalité ↗ avec la dose mais la cinétique de
réparation est constante

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