ppt1 - Laboratorio de Fisicoquímica Biológica

Report
Fundamentos de
Espectrometría de Masa
Biológica
Matías Möller
8 de mayo de 2014
Lab. Fisicoquímica Biológica
Instituto de Química Biológica
Facultad de Ciencias
Universidad de la República
1
Bibliografía recomendada:
Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed.
Cap. 15.
J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.
Introduction to proteomics, Liebler, 2002.
Mass spectrometry in structural biology and
biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap. 3
2
Espectrometría de masa
1- Generalidades
2- MALDI-TOF
3- ESI-Q
4- Peptide Mass Fingerprinting y
tandem MS
3
Espectrometría de masa
1- Generalidades
4
Espectrometría de masa
Técnica que permite la
separación y determinación de
la relación masa/carga de
iones gaseosos
5
Espectrometría de masa
Espectrometría ≠ Espectroscopía
(Medición de un rango)
(implica absorción o
emisión de energía radiante)
6
Espectrometría de masa
Espectrometría de masa de Biomoléculas
Determinación de masa y/o composición:

Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares

Polisacáridos, oligosacáridos

Lípidos  Lipidoma

Fragmentos de ácidos nucleicos
Técnica muy sensible:
puede analizar mg-ng (y menos) de material
7
Espectrometría de masa
Espectrometría de masa de Proteínas

Determinación de masa y/o composición

Identificación por comparación con bases de datos
(peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos

Modificaciones postraduccionales

Complejos Supramoleculares:
Interacción entre proteínas
Interacción con compuestos de bajo PM

Plegamiento

Niveles de expresión/modificación posttraduccional
8
Gel 2D de
hígado humano
http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/
9
Masa (definiciones)
• Se determina
• q = ±ze ,
m/z
e = 1.6022 x 10-19 coulomb
• z siempre es un integral positivo
10
Masa
• Todas las moléculas tienen una composición química única,
pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la
presencia de isótopos (mismo número de protones pero
diferente número de neutrones)
6
12
13
14
12.011
6
6
6
C
C C C
11
Elemento
Masa
%
1H
1.0078
99.985
2H
2.0141
0.015
12C
12.0000
98.90
13C
13.0034
1.10
14N
14.0031
99.634
15N
15.0001
0.366
16O
15.9949
99.762
17O
16.9991
0.038
18O
17.9992
0.200
31P
30.9738
100.00
32S
31.9721
95.02
33S
32.9715
0.75
34S
33.9679
4.21
36S
35.9671
0.02
79Br
78.9183
50.69
81Br
80.9163
49.31
12
Carlos Cerveñansky
Masa
• La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes
en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1%
• Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los
elementos pesados se vuelven importantes
13
Masa
• Ejemplo:
12C (98.9%) y 13C (1.1%)
En Buckminsterfullereno (C60)
La probabilidad que todos los átomos sean 12C:
P = (0.989)60 = 0.515
14
Masa
15
Masa
16
Masa: definiciones
• Masa molecular se mide en unidades de masa atómica
unificadas (u)
• u = m(12C) /12 = 1.6605402 × 10-27 kg
(u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u.,
considerado ahora -2009- arcaico)
• Peso atómico: promedio por composición isotópica →
Peso molecular
• Masa nominal: masa calculada con los isótopos más
livianos, redondeado al entero
• Masa más abundante
17
• Masa promedio
Masa: definiciones
18
Carlos Cerveñansky
Masa: definiciones
19
Determinación del número de cargas (z)
100
95
90
524.3
85
80
75
Una sola carga:
Delta = 1.0 amu
70
Relative Abundance
65
60
55
50
45
Delta = 1.0 amu
40
35
30
525.3
25
Delta = 1.0 amu
20
15
10
526.2
5
0
520
521
522
523
524
m/z
525
526
527
528
529
20
Determinación del número de cargas (z)
100
95
262.6
90
85
80
75
70
Relative Abundance
65
60
Dos cargas:
Delta = 0.5 amu
55
50
45
Delta = 0.5 amu
40
35
30
25
263.1
20
Delta = 0.5 amu
15
10
263.6
5
0
258
259
260
261
262
263
m/z
264
265
266
267
21
Espectrometría de masa de proteínas
37 kDa
37136 amu
22
Espectrometría de masa
Los Iones son importantes
En el proceso de Ionización se forman diferentes
tipos de iones  cambios en m/z:
[M+H]+ o [M-H]De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,
fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)
[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-
De la unión de iones especialmente a moléculas que
contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da)
[M]*+, [M]*(oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)
23
Espectrometría de masa
M(péptido) = 1162 Da
Modo positivo
m=
+1 +23 +39
Modo negativo
-1
24
Espectrometría de masa
Espectrómetro de masa
Muestra
Entrada:
Volatilización/
Ionización
MALDI
ESI
Analizador
de masas
TOF
Cuadrupolo
Tampa de Iones
FTICR
Orbitrap
Sector Magnético
Detector
Alto
Vacío
25
Espectrometría de masa
¿Cómo volatilizar una proteína?
Premio Nobel de Química 2002
Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization
Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization
Sin Premio:
Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI
(como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)
26
Espectrometría de masa
Espectrómetros de masa
(configuraciones para grandes biomoléculas)
MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight
ESI-Q:
ElectroSpray Ionization-Quadrupole
ESI-IT:
ElectroSpray Ionization-Ion Trap
FT-MS:
ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance
Orbitrap:
ESI-orbitrap
27
Espectrometría de masa
2- MALDI-TOF
28
Espectrometría de masa
Ionización por MALDI:
(Matrix assisted Laser desorption/ionization)
(Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz)
Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe
energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación
de la muestra:
29
Espectrometría de masa
Ionización por MALDI:
La energía agregada hace que la
matriz “explote”, llevando la proteína
cargada hacia la entrada del
analizador.
El proceso de desorción está asociado
con una transferencia de H+.
Las proteínas cargadas son dirigidas al
analizador mediante un campo
eléctrico
30
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Matriz: acidos aromaticos
31
Espectrometría de masa
4HCCA
DHBA
SA
32
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo
a su “tiempo de vuelo”(t).
t  (m/z)1/2
las partículas con menor m/z llegan antes al detector
No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y
tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)
33
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son
acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una
energía cinética:
Ek = zeEs
donde s es la distancia de la región de la fuente.
E
+
-
+
+
s
Fuente
D
34
Detector
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa
ningún campo.
Ek = zeEs = ½mv2  v = (2zeEs/m)½
E
+
-
Sin E, iones a la deriva
Fig. Separación por TOF
+
+
s
Fuente
+
+
D
Detector
35
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa
ningún campo.
Los iones con igual carga tienen la misma Ek,
v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D
 m/z = 2eEs(t/D)2
36
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
E
+
-
Sin E, iones a la deriva
Fig. Separación por TOF
+
+
s
Fuente
+
+
D
Detector
½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2
37
Espectrometría de masa
Tubo de
vuelo
4-25 kV
Detector
Carlos Cerveñansky
38
Espectrometría de masa
Tubo de
vuelo
4-25 kV
Detector
Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t
Carlos Cerveñansky
39
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Generalmente se observa la especie monocargada (M+H)+
40
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF
Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM
41
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Se pueden estudiar masas en un amplio rango
42
Resolución en MALDI-TOF
V oyager S pec #1=>BC=>RS M10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]
1672.917
1672.92
100
3222.3
90
80
% Intensity
70
60
50
Modo lineal
Resolucion: 2467
(FWHM)
40
30
20
10
0
1655.0
1662.2
1669.4
1676.6
1683.8
0
1691.0
M ass (m/z )
V oyager S pec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]
1672.918
100
1.6E +4
90
80
% Intensity
70
60
50
Modo reflector
Resolucion:8500
(FWHM)
40
30
20
10
0
1655.0
Carlos Cerveñansky
1662.2
1669.4
1676.6
M ass (m/z )
1683.8
0
1691.0
43
Espectrometría de masa
3- ESI-MS
44
Espectrometría de masa
ESI
ElectroSpray Ionization
Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar
sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2
(gas secante).
N2
El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas
cargadas (spray)
45
Espectrometría de masa
ESI
ElectroSpray Ionization
Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va
evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas
que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta
que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia
el analizador
N2
46
Espectrometría de masa
ESI-Q
Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama
“Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de
un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son
neutralizados y eliminados.
Consiste en cuatro barras
cilíndricas metálicas que
sirven de electrodos del
filtro de masas
47
Espectrometría de masa
ESI-Q
Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible
variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un
barrido espectral
Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no
tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000
48
Espectrometría de masa
Trampa de iones
Analizador de masas muy
utilizado con ESI, atrapa los
iones mediante voltajes
oscilantes en los electrodos,
enfocando los iones en el
centro de una “caja”.
49
Espectrometría de masa
ESI-MS
La ionización de proteínas por ESI generar iones
con diferente número de cargas, por adición de
diferente número de protones
m/z = (M+n)/n
Donde n es el número de protones
(masa = 1.0078 u, ~ 1)
50
ESI y carga
[M+2H]2 +
674.7
100
Substance P
%
[M+H] +
685.7
462.8
600.4 666.1 693.6
1347.7
0
300
Da/e
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
14+
13+
12+
11+
10+
9+
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
52
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
14+
13+
12+
11+
10+
9+
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
53
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
(n+1)+
n+
x1 = (M+n)/n
x2 = (M+n+1)/(n+1)
 n = (x2-1)/(x1-x2)
n = (1084.1-1) / 72.1 = 15
M = (1156.2 x 15) -15 = 17328
54
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo
55
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
Bajo PM
Alto PM
56
Espectrometría de masa
ESI-MS
Resolución de varias especies
57
Espectrometría de masa
Comparación ESI-MS y MALDI-TOF
Cyt C
58
Espectrometría de masa
Comparación
MALDI-TOF
ESI-(Q3 o IT)
Pocas, en general 1
Muchas
50000
3000
Rango de masas
200.000
70.000
Interacciones no
covalentes
No
Si
limitado, PSD
Si, CID
Acoplar LC
No
Si
Tolerancia a
contaminantes
Si
No
Cargas/ion
Rango de m/z
MS/MS
59
Espectrometría de masa
Conclusión
Permite determinar la masa molecular con muy
alta resolución
La espectrometría de masa es la técnica de
elección para determinar la masa molecular de
proteínas
60
Continuará…
61
Seroalbúmina humana
+49
+54 +52
+53 +51+50
+55
+56
+48
+44
+47
+46 +45
62
Lucía Turell
Seroalbúmina humana
66437
6
Intensidad relativa
8x10
6
6x10
66453
6
4x10
66469
6
2x10
0
66300
66400
66500
66600
Masa (Da)
63
Lucía Turell

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