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Report
ISTITUTO NAZIONALE PER LO
STUDIO E LA CURA DEI TUMORI
FONDAZIONE G. Pascale – NAPOLI
SC Biologia Cellulare e Bioterapie
CENTRO RICERCHE ONCOLOGICHE
MERCOGLIANO (AV)
Laboratorio di Farmacogenomica
Raccomandazioni di AIOM e SIAPEC-IAP
Nicola Normanno
BRIM-3 (NO25026): Phase III Study in Previously
Untreated Patients with Metastatic Melanoma
•
•
International, multicenter, randomized, open-label Phase III study
This study is currently ongoing
Estimated enrollment: 680 patients
o Unresectable metastatic melanoma (stage
IIIc/IV, AJCC)
o BRAFV600 mutation positive, determined
by cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test
o Chemo-naïve for advanced disease
Vemurafenib
(960 mg BID orally)
o
•
1:1
N=680
Dacarbazine
(1000 mg/m2 IV q3w)
Co-primary endpoints:
– Overall survival
– PFS
•
Key secondary endpoints:
–
–
–
–
Efficacy: BORR, time to response, duration of response, time to treatment failure
Safety and tolerability
Pharmacokinetics
Contribute to validation of cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test
NCT01006980. Available at www.clinicaltrials.gov (last accessed August 10, 2010).
Chapman P. et al Abs LBA4 ASCO 2011
Progression-free survival (%)
Progression-free survival (February 01, 2012 cut-off)
censored at crossover
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Vemurafenib (n=337)
Dacarbazine
(n=338)
1.6
6.9
0
No. at risk
Dacarbazine
Vemurafenib
338
337
Hazard ratio 0.38
(95% CI: 0.32–0.46)
Log-rank p<0.001 (post-hoc)
6
100
269
63
186
12
Time (months)
37
113
22
77
18
14
49
3
16
24
0
3
0
0
Chapman P. et al. abs 8502
ASCO Ann. Meeting Chicago 2012
Overall survival (%)
Overall survival (February 01, 2012 cut-off) censored
at crossover
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Vemurafenib (n=337)
Median f/u 12.5 months
Hazard ratio 0.70
(95% CI: 0.57–0.87)
p<0.001 (post-hoc)
Dacarbazine (n=338)
Median f/u 9.5 months
9.7
0
No. at risk
Dacarbazine
Vemurafenib
338
337
6
244
326
173
280
13.6
12
Time (months)
111
231
79
178
18
50
109
24
44
24
4
7
0
1
Chapman P. et al. abs 8502
ASCO Ann. Meeting Chicago 2012
 The trial enrolled 20 patients with non-V600E mutations (19 with V600K
and 1 with V600D)
 4 of 10 patients with the BRAF V600K mutation had a response to
vemurafenib
BRAF Mutations Affect Kinase Activity
• Ninety percent of BRAF mutations in melanoma result in
substitution at position V6002
– All tested mutations at V600 are classified as high-activity
mutants when compared with BRAFwild-type (WT)3,4
– These mutations constitutively stimulate ERK phosphorylation3
• A unifying feature of the high- and intermediate-activity
BRAF mutants is that they disrupt the hydrophobic
interaction between the P loop and the activation segment
of the kinase domain4
– This results in destabilization of the inactive conformation of
BRAF, thus stimulating its kinase activity and leading to
increased ERK phosphorylation
BRAF Mutation at
Position V600
Melanomas (Total
2,651 V600X)1
Relative Frequency
(%)1
V600E
2,436
91.9
V600K
162
6.1
V600D
35
1.3
V600R
18
0.7
BRAF kinase domain structure. Position 600 is indicated in
yellow. The BRAF activation segment is shown in purple;
dashes indicate the region that was not resolved. The P
loop is shown in green (adapted from Garnett MJ, et al).2
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B; ERK = extracellular signal―regulated kinase; WT = wild-type.
3. Wan PTC, et al. Cell 2004;116:855–67.
1. Forbes SA, et al. Nucleic Acids Res 2010;38:D652–7
4. Pritchard C, et al. Biochem Soc Trans 2007;35:1329–33.
2. Garnett MJ, et al. Cancer Cell 2004;6:313–9.
FDA NEWS RELEASE
For Immediate Release: Aug. 17, 2011
FDA approves Zelboraf and companion diagnostic test for late-stage skin cancer
Second melanoma drug approved this year that improves overall survival
The U.S. Food and Drug Administration today approved Zelboraf (vemurafenib),
a drug to treat patients with late-stage (metastatic) or unresectable (cannot be
removed by surgery) melanoma, the most dangerous type of skin cancer.
Zelboraf is specifically indicated for the treatment of patients with melanoma
whose tumors express a gene mutation called BRAF V600E. The drug has not
been studied in patients whose melanoma tests negative for that mutation by
an FDA approved diagnostic.
Zelboraf is being approved with a first-of-a-kind test called the cobas 4800
BRAF V600 Mutation Test, a companion diagnostic that will help determine if a
patient’s melanoma cells have the BRAF V600E mutation.
The BRAF protein is normally involved in regulating cell growth, but is mutated
in about half of the patients with late-stage melanomas. Zelboraf is a BRAF
inhibitor that is able to block the function of the V600E-mutated BRAF protein.
Types of BRAF mutation
Arkenau BJC 2011
Classificazione Istopatologica
• Istotipi principali:
 melanoma a diffusione
superficiale
 melanoma su lentigo
maligna
 melanoma acrale
lentigginoso
 melanoma nodulare
•





Istotipi rari:
melanoma desmoplastico
melanoma nevoide
melanoma spitzoide
melanoma su nevo
melanoma mucoso
lentigginoso
 nevo blu maligno
• Varianti con caratteri citologici peculiari quali il
melanoma a piccole cellule, a cellule fusate, a cellule
ad anello con castone, il melanoma rabdoide, il
melanoma plasmocitoide.
Fattori prognostici morfologici istopatologici
• Lo spessore del tumore, valutato istologicamente dal punto
più profondo di invasione sino allo stato granuloso
dell’epidermide;
• La presenza di ulcerazione;
• Il numero di mitosi/mm2;
• L’evidenza di satellitosi microscopica
• La presenza o assenza di metastasi linfonodali o a distanza.
BRAF Mutations in Melanoma
• There is a strong inverse correlation between age and the likelihood of BRAF
mutation in melanoma1
– Age <55 years is the single most predictive factor of BRAF mutation reported2
– This group of patients also presented with metastases to regional nodes more frequently2
• Melanomas positive for oncogenic BRAF are reported to show distinct
morphological features2
– Increased upward migration and nest formation of intraepidermal melanocytes
– Thickening of the involved epidermis, with sharper demarcation to the surrounding skin
– Larger, rounder, and more pigmented tumor cells
Nesting
Cell shape
Pigmentation
No nesting
Extensive nesting
Round
Spindled
Absent
Very high
Grading of cellular morphological features. Examples indicate the extent of nesting, cell shape, and pigmentation (adapted from Viros A, et al).2
1. Flaherty KT, et al. Cancer 2010;116:4902–13.
2. Viros A, et al. PLoS Med 2008;5:e120.
Frequency distribution of genetic alterations in
BRAF, NRAS, and KIT in melanoma
Curtin JCO 2006
Il campione istologico
• Il campione istologico può essere rappresentato da lesioni
primitive o metastatiche (cutanee, linfonodali o viscerali).
• E’ comunque preferibile un campione di lesioni
metastatiche, nelle quali la componente di cellule
neoplastiche è in genere maggiormente rappresentata
rispetto a quanto osservato nei melanomi primitivi.
• Il tessuto tumorale può essere prelevato mediante una
biopsia incisionale o essere costituito da un campione
operatorio.
• L’indagine molecolare può essere eseguita: 1) su tessuto
fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE); 2) su
campione tissutale fresco; 3) su tessuto congelato a -80°C.
Consistency Between BRAF/NRAS Mutation
Status in Primary and Secondary Lesions in
Patients With Melanoma
Colombino JCO 2012
Polyclonality of BRAF mutations in melanoma
Lin BJC 2011
Heterogeneity of BRAF mutations in melanoma
Yancowitz Plos One 2012
Dissezione tessutale
• La possibilità di identificare mutazioni puntiformi in genere è
condizionata dalla percentuale di cellule tumorali ed in parte
anche dalla quantità di pigmento melanico.
• È pertanto utile per questo tipo di tumore una “macromicroselezione” al fine di “arricchire” il campione , e di
ridurre il più possibile le potenziali interferenze del pigmento
melanico sulla qualità del DNA estratto.
• Le procedure di arricchimento contemplano le metodiche di
dissezione (micro e macrodissezione tissutale) e/o di
carotaggio
• Può essere utile sottoporre le sezioni ad un protocollo di
decolorazione (melanin bleach).
Il campione citologico
Il materiale di archivio di campioni citologici è costituito da:
• preparati citologici strisciati, colorati e montati su vetrino;
• materiale citologico incluso in blocchi di paraffina
(citoinclusi);
• campioni citologici in sospensione per allestimento di strisci
su strato sottile.
Estrazione del DNA
• Per l’estrazione e purificazione del DNA da tessuto
paraffinato sono oggi disponibili vari kits commerciali,
in genere basati sul principio della cromatografia
• I kit consentono di accorciare notevolmente i tempi
necessari per l’estrazione e, al contempo, favoriscono la
standardizzazione delle procedure
• Una volta estratto, il DNA viene risospeso in tampone
adeguato, quindi valutato sotto il profilo
qualità/quantità mediante lettura spettrofotometrica o
tramite visualizzazione su gel d’agarosio.
• Per la valutazione dell’amplificabilità del DNA purificato
da tessuti in paraffina, una PCR quantitativa può
risultare molto più accurata della spettrofotometria
How do methods compare by performance?
Method
Limit of detection
(ie, minimum % of mutant alleles in a
wild type background required for
reliable mutation detection)
Sequencing/PCR
Around 20-30%
PLA-LNA clamp
Reportedly below 1%
ARMS (Therascreen)
Up to 1%
Analytical Range of mutations
sensitivity detected
80-85%
Comprehensive
Limited
90-95%
PCR Invader®
Limited
Limited
Pyro-sequencing
Reportedly 1-10%
90-95%
Near comprehensive
High-ResolutionMelting (HRM)
10-20%
80-85%
Near comprehensive
SNaPshot®
5–10%
PCR/flRFLP
5-10%
Fragment analysis
Approximately 5%
90-95%
Insertions/deletions
CE-SSCP/DHPLC
5-10%
90-95%
Near comprehensive
Molecular testing in melanoma
Woodman CCR 2012
Kit commerciali o metodiche sviluppate in
laboratorio?
• I kit diagnostici presentano numerosi vantaggi rispetto al
sequenziamento diretto: risultano più rapidi e sensibili,
utilizzano protocolli standardizzati, sono in genere forniti di
adeguati controlli positivi e negativi, ed in alcuni casi sono
stati anche approvati per l’impiego clinico in Europa (CE-IVD).
• Sebbene quest’ultimo punto non sia al momento un requisito
indispensabile per l’attività di diagnostica molecolare,
l’approvazione di un saggio per l’impiego clinico rappresenta
sicuramente un valore aggiunto rispetto a metodiche
sviluppate a scopo di ricerca.
• Per le metodiche sviluppate autonomamente, i laboratori
devono dimostrare la loro sensibilità e specificità
Sequenziamento diretto del prodotto di PCR
• Le mutazioni attivanti il gene BRAF, attualmente
indispensabili per l’uso di farmaci inibitori di BRAF
nel trattamento del melanoma metastatico, sono
localizzate nell’esone 15 del gene.
• Pertanto, l’intero esone o parte dell’esone devono
essere amplificati prima di procedere all’analisi
mutazionale mediante sequenziamento.
Sequenziamento diretto del prodotto di PCR
• Allestire le reazioni PCR sotto cappa a flusso laminare, in un ambiente
diverso da quello utilizzato per l’analisi dei prodotti di amplificazione,
impiegando materiali dedicati e con le opportune precauzioni onde
evitare contaminazioni.
• Introdurre almeno un controllo positivo per mutazione ed un controllo
negativo.
• Per ogni campione da analizzare, effettuare due distinte reazioni PCR che
saranno sottoposte a sequenziamento in forward e reverse, in modo da
ottenere un numero di 3-4 sequenze per campione.
• Considerare il campione come positivo per mutazione solo se questa è
presente in almeno due diverse sequenze (una forward ed una reverse)
ottenute da PCR indipendenti.
• Ad intervalli di 25-30 sequenze, sequenziare dei DNA di controllo per
verificare l’assenza di contaminazioni e la qualità della processo.
• Verificare che l’efficienza della procedura garantisca un corretto risultato
in almeno il 97% dei campioni e che la sensibilità del metodo non risulti
superiore al 20%.
Analisi mediante Pirosequenziamento
• Le metodiche di pirosequenziamento hanno alcuni vantaggi
rispetto al sequenziamento standard, tra cui la maggiore
sensibilità (riportata tra il 5 ed il 10%) e la possibilità di
sequenziare frammenti piuttosto corti di DNA, superando in tal
modo eventuali problematiche legate alla frammentazione del
DNA.
• Sono disponibili in commercio alcuni Kit per la determinazione
delle mutazioni del gene BRAF basati sul pirosequenziamento
Analisi mediante Real Time PCR
• Le metodiche di RealTime PCR, in generale, possiedono una
maggiore sensibilità rispetto agli approcci basati su
PCR/sequenziamento.
• Le metodiche di Real Time PCR presentano anche il
vantaggio di poter ottenere un buon livello di amplificazione
anche in caso di DNA frammentato
• L’impiego della RealTime PCR è facilitato dall’osservazione
che nel melanoma le mutazioni predittive di risposta al
vemurafenib sono concentrate nel codone 600
Analisi mediante Real Time PCR
• Esistono in commercio numerosi kit per la determinazione
delle mutazioni di BRAF mediante RealTime PCR.
• Questi saggi sono in genere basati sulla metodica della
discriminazione allelica, alcuni impiegano anche tecniche per
la amplificazione preferenziale del DNA mutato (PNA clamp,
• primer ARMS, etc.).
• La maggioranza dei kit disponibili è stata disegnata per
individuare la sola mutazione V600E. Tuttavia, alcuni kit
presentano una documentata reattività crociata anche per
altre mutazioni di BRAF in posizione V600, quali la V600K e
la V600D, e pertanto sono in grado di rilevare anche queste
mutazioni.
cobas® BRAF V600 Mutation Test
Luke CCR 2012
Analisi mediante Real Time PCR
• È possibile anche progettare e validare in proprio metodiche
di Real Time PCR per la individuazione delle mutazioni di
BRAF.
• In questo caso, la metodica deve essere disegnata in modo
da rilevare le principali mutazioni V600 di BRAF.
• La sensibilità minima raccomandata è del 10%.
Raccomandazioni per l’analisi mediante Real
Time PCR
• La elevata sensibilità della Real Time PCR può essere fonte di
contaminazioni. Le reazioni devono essere allestite sotto
cappa a flusso laminare, in un ambiente diverso da quello
utilizzato per l’analisi dei prodotti di amplificazione,
impiegando materiali dedicati e con le opportune
precauzioni
• Appropriati controlli positivi e negativi devono essere
sempre inclusi in ogni singola determinazione
• Le reazioni devono di norma essere eseguite in duplicato
• In caso di metodiche sviluppate nei laboratori, queste
devono essere validate, ovvero è indispensabile stabilire la
sensibilità e l’ambito di specificità del saggio
Analisi mediante Ibridazione molecolare su filtro
• È disponibile sotto forma di kit commerciale un saggio per
l’identificazione della sola mutazione BRAF V600E basato
sulla PCR e sull’ibridazione inversa.
• La procedura prevede l’amplificazione tramite PCR con
primer biotinilati del DNA in analisi e l’ibridazione dei
prodotti amplifi cati su una striscia contenente sonde
oligonucleotidiche allele-specifiche.
• Il saggio identifica la mutazione V600E con una sensibilità
dell’1% circa ed è stato approvato per l’impiego clinico.
• Il kit è corredato di vari controlli che permettono di
monitorare l’efficienza della reazione PCR e dell’ibridazione
molecolare.
BRAF mutations: Sequencing vs COBAS
Anderson Arch Pathol Lab Med 2012
BRAF mutations: Sequencing vs COBAS
Halait Diagn Mol Pathol 2012
Refertazione - Diagnostica istopatologica
Il referto istopatologico di melanoma deve comprendere le
seguenti informazioni:
1. Una descrizione macroscopica che identifichi i margini di
resezione chirurgici e la distanza della neoplasia dal
margine più vicino
2. Una descrizione microscopica che indichi i parametri
istopatologici prognostici importanti ai fi ni della
stadiazione patologica, ed indicazioni ad ulteriori eventuali
procedure di stadiazione (biopsia del linfonodo sentinella).
3. Qualora siano eseguite colorazioni immunoistocitochimiche queste devono riportate specificando gli
anticorpi utilizzati e/o eventuali metodiche FISH con
l’indicazione del cut-off utilizzato nella valutazione.
Refertazione – Analisi mutazionale di BRAF
• Il referto della determinazione dello stato mutazionale di
BRAF deve contenere le seguenti informazioni:
1. Identificazione del paziente
2. Identificazione del medico/struttura che ha richiesto l’analisi
3. Materiale utilizzato
4. Percentuale di cellule tumorali
5. Metodica/metodiche impiegata/e
6. Mutazioni indagate
7. Risultati del test con specificazione del tipo di mutazione
eventualmente rilevata.
Refertazione – Analisi mutazionale di BRAF
• Il referto deve essere compilato su un modello prestabilito, e
firmato dall’anatomo-patologo e dall’esecutore del test
molecolare.
• In considerazione dell’impatto dell’esito del test sulla
strategia terapeutica, il tempo per la refertazione non deve
superare le due settimane dalla richiesta della
determinazione.

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