Stáhnout

Report
Replikace DNA
-
DNA replikace (kapitola 10)
Replikace chromozómu u bakterií (kapitola 10)
Replikace plasmidů (částečně kapitola 25 + 20)
Replikace lineárních chromozómů u Eukaryot (kapitola 10)
PCR (kapitola 6)
Buněčné dělení vs. reprodukce
Jednobuněčný organismus
Mnohobuněčný organismus
• Buněčné dělení a
reprodukce je simultální
• Buněčné dělení vede k
diferenciaci (zvětšení
objemu jedince a jeho
komplexity)
• Reprodukce
• Prokaryota (baktérie)
• Eukaryota (Protista)
• asexuální
• sexuální (meióza)
• Horizontální přenos genů - přenos DNA bez reprodukce
• Vertikální přenos genů - z generace na generaci
DNA struktura
antisense
vlákno
sense
vlákno
fosfodiesterová
kostra
báze
malý
žlábek
velký
žlábek
DNA se skládá ze dvou antiparalelních řetězců tvořící většinou pravotočivou šroubovici.
Báze jsou uvnitř, fosfo-diesterová kostra zvnějšku.
DNA replikace
• 50. léta
DNA replikace - Meselson-Stahl
pokus
• 1958
• „ the most beautiful experiment in biology“
DNA replikace
• DNA musí být rozdělena na 2 vlákna (enzymatický komplex
replisome)
• Každé vlákno je replikováno (původní vlákno slouží jako
templát) – replikace je semikonzervativní
Obecný mechanismus
replikace
• Počátek replikace (ori)
• DNA polymeráza (DNAP)
• Vždy ve směru 5‘  3‘
• Leading strand vs lagging strand
Obecný mechanismus
replikace
• DNA polymeráza potřebuje RNA primer
• Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp)
• Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou
DNAP
• Ligace niků
Obecný mechanismus
replikace
• Nukleotidy jsou prekurzory pro DNA syntézu
• dNTPs jsou vytvořeny z NTPs ribonucleotide
reduktázou, kromě dUTP
Obecný mechanismus
replikace
• Polymerizace nukleotidů
Obecný mechanismus
replikace
• DNA polymeráza (Objevena v roce 1956 A.
Kornbergem (E.coli)
•
•
•
•
Syntetizuje ssDNA ve směru 5‘ - 3‘
Může mít exonukleázovou aktivitu ve směru 3‘- 5‘
Potřebuje primer
Neumí rozplétat dvouvlákno
• DNA polymeráza III – replikační enzym
• DNA polymeráza I – odstraňuje primery
• DNA polymeráza II – reparační enzym
DNA polymeráza III
• Několik podjednotek
•
•
•
•
•
DnaE (-podjednotka, syntéza)
DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita)
HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu)
DnaN (-podjednotka)
Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex
DNA polymeráza III
• Korekturní aktivita – proofreading activity
• 1 chyba na 109 bází
Syntéza lagging, opožďujícího
se vlákna
• Okazakiho fragmenty
• Priming complex – primosom
• PriA vyváže SSB
• Naváže se primáza (DnaG)
• Syntetizuje krátký RNA fragment
Syntéza lagging, opožďujícího
se vlákna
• Ukončení syntézy
• Série fragmentů, které nejsou
spojeny
• 3-krokové spojení daných
fragmentů: Ribonukleáza H, DNA
polymeráza I a DNA ligáza
Topologické problémy při
replikaci DNA
• Rozpletení dvoušrobovice (800b/s) pomocí helikázy
• Oba řetezce je nutno oddělit a prootočit (-100 na 1000b)
• Chromozom nemůže jen tak rotovat
• Vzniklé napětí je uvolněno topoisomerázami (DNA gyrázou)
• DNA gyráza zavádí negativní superspiralizace a tím uvolňuje pozitivní
superspiralizaci způsobenou helikázou
Replikační proteiny v E.coli
DnaA
Váže se na počátek replikace (ori)
Helicase
Uvolňuje dsDNA
DnaC
Pomáha helikáze při vazbě na DNA
SSB
Udržuje ssDNA
Primase
Syntéza RNA primerů
RNaseH
Odstranění RNA primerů
PolI
Vyplňuje mezery mezi Okazakiho fragmenty
Polymerase III
,,,,,,, ‘,,
DNA ligase
Liguje niky, zvlášte pak v lagging vláknu
DNA gyrase
 a  podjednotka, zavádí negativní supercoily
Topoisomerase IV
Štípe a liguje dsDNA, uvolňuje pozitivní otáčky
Komplex replikační vidličky
• Proteiny, které se účastní replikace
•
•
•
•
DNA gyráza
Helikáza
Single-strand binding protein
DNA polymerase
Replikace kruhové molekuly
•
•
•
•
Baktérie
2 replikační vidličky (-replikace)
DNA replikace a buněčné dělení je synchronizováno
iniciace replikace v ori (oriC)
• Iniciační komplex obsahuje 5 proteinů: DnaA, DnaB, DnaC, DNA
gyrázu, SSB
• oriC obsahuje repetice 3x GATCTNTTNTTTT a 4x TTATNCANA
• Vazba DnaA proteinu
• Na rozvolněnou DNA se naváže DnaB a DnaC – začátek replikační
vidličky
• Helikáza aktivuje primázu a tím pádem syntézu primeru
Replikace kruhové molekuly
• Ukončení replikace – Ter místa
• Replikace probíha v obou
směrech (po směru a proti směru
hodinových ručiček)
•
•
•
•
TerC, TerB, TerF
TerA, TerD, Ter E
Vážou Tus proteiny
Jejich delece jsou slučitelné se
životem, replikační vidlička je
nepotřebuje k ukončení replikace
• Separace spojených molekul
toposiomerázou IV
Buněčné dělení a replikace
• Generační čas E. coli od
20-ti minut po několik
hodin
• Replikace chromozómu
vždy 40minut
• Kompletace buněčného
dělení 20 minut
Replikon
• Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo
linearní)
• Genomy virů, viroids
• Chromozómy - kruhové
• Chromozómy - lineární (konce musí být chráněné před
exonukleázovou aktivitou – smyčky, nebo proteiny)
• Genomy mitochondrií a chloroplastů
• Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární)
• Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek)
• Mitochondrie
• Plastidy (primární a sekundární)
Plasmidy
• Kruhové molekuly DNA samostatně se množící
• Vyjímka jsou lineární plasmidy a RNA plasmidy (zjednodušené RNA
viry)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Parazitují na buněčném aparátu pro svou replikaci
Přinášejí buňce určitou selekční výhodu
Nemohou být bez buňky
Vyskytují se v různém počtu (obvykle 1-2 plasmidy/chromozóm, ale
až 50)
Velikost plasmidu je velmi různá
Plasmidy mohou nést gen zajišťující resistenci na antibiotikum
Kryptické plasmidy (bez očividné funkce)
F-plasmidy – specificke pro E.coli a baktérie rodu Shigella a
Salmonela
P-plasmidy – promiskuitní
Transferability vs mobility
Některé plasmidy mohou být lineární (z Borrelia a Streptomyces)
Lineární plasmidy - vyjímka
• Nalezeny u některých baktériích a hub
• Nemají telomery
• Vlásenková struktura chrání konce DNA u Borrelia (plasmid je
velmi důležitý pro virulenci borélií)
• dsDNA vazebné proteiny chrání konce DNA u Streptomyces
Replikace plasmidu
• Obousměrná replikace
• Replikace valivou kružnicí
Replikace valivou kružnicí je
také používána viry
• Stejný mechanismus replikace ukazuje na příbuzný vztah mezi
plasmidy a viry
Mechanismus replikace
plasmidu F - konjugace
• Nejstarší známý plasmid (byl náhodou přítomne v izolátu E.coli
K12, Stanford, 1928)
• Nízké copy number, 100kb
• Konjugativní vlastnosti
•
•
•
•
Tra+ transfer positive plasmidy
tra geny (nejméně 30 genů)
F+ (donor) and F- (recipient)
Bakteriální sex
Mechanismus replikace
plasmidu F - conjugation
• Replikace valivou kružnicí
• ssDNA se pohybuje skrz konjugační most do druhé buňky
• Některé malé plasmidy jsou tra-, ale mob+ (mohou být mobilizovány
za přítomnosti Tra+ plasmidu)
Přenos chromozomální DNA
díky F-plasmidu
• Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion
sequence)
• baktérie, které mají F plasmid v chromozómu - Hfr strains
• Celý chromozóm může být přenesen za 90 minut
• F plasmid se umí vyštípnout z chromozómu, nese část
chromozómu – F‘ plasmid
Přenos chromozomální DNA
díky F-plasmidu
• Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion
sequence)
Kontrola počtu plasmidů v
buňce pomocí anti-sense RNA
• High copy plasmid regulují svůj počet pomocí limitace startu
replikace
• Low copy plasmid – striktní regulace, replikují se s replikací buňky
• Regulace studovaná pro plasmid ColE1
• Iniciace replikace ColE1
• Syntéze pre-primeru (555bp) – RNA_II
• Je štípnut ribonukleázou H (volný 3‘-OH)
• Tento enzyme je specifický pro DNA:RNA
•
•
•
•
•
•
DNA polymeráza pokračuje
NEBO
Syntéza RNA_I – 108bp, váže se na RNA_II
Ribunukleáze nemůže štípnout RNA_II
DNA polymeráza nemá volný 3‘-OH konecx
Replikace nemůže začít
Závislost buňky na plasmidu
• Buňka přežije pouze v případě, že si udrží plasmid
• 2 komponenty produkované plasmidem: toxin (více stabilní) and
protijed (méně stabilní)
• Protein-based operon F-plasmidu: CcdA (protijed) a Ccd B (toxin,
inhibuje DNA gyrázu)
• RNA-based systém: protijed je antisense RNA, která neumožňuje
translaci toxinu (Hos-killing protein – Hok and Sok antisense RNA)
• Benefiční plasmidy
• Resistence na antibiotika
• Resistence na těžké kovy
• Resistence vůči UV atd. (Table 20.01)
Plasmidy s resistencí na
antibiotika
• R plasmidy
• Objeveny během 2.svět. války v
Japonsku
• Bacteria Shigella resistentní vůči
sulfonamidům
• R plasmidy jsou transferu schopné
• Resistentní kmeny baktérií jsou velmi
problematické
• Zákaz používaní lidských antibiotik na
prevenci nákazy u zvířat
• Použití v genovém inženýrství
Resistance vůči -laktam
antibiotikům
• Nejrozšířenější skupina antibiotik (penicilín, ampicilín,
cephalosporin)
• Působí na buněčnou stěnu baktérií
• Obsahují -laktam kruh
• Resistence díky enzymu -laktamázy (bla gen)
• Modifikace antibiotické struktury – více odolná na štěpení enzymem
• Administrace antibiotika + lactam analogu (clavulanic kyselina),
který se váže na enzym
Resistence to chloramphenicol
• Chloramphenicol, streptomycin a kanamycin
• Působí na bakteriální translaci (vážou se na 23S rRNA)
• Resistence:
• Chromozomální mutace ribosomálních proteinů – nedojde k
inhibici pomocí antibiotika, ale sníží se efikace translace
• Plasmidová – chloramphenicol acetyl transferáza (CAT)
Rezistence na aminoglykosidy
•
•
•
•
Streptomycin, kanamycin, neomycin
Obvykle 3 cukerné kruhy, z nichž alespoň jeden nese aminokyselinu
Vážou se na SSU ribozómu a inhibují translaci
Inaktivace jejich aktivit pomocí modifikací (fosforylace, acetylace,
adenylace)
• Resistence: neomycin phosphotransferase (npt gen)
• Derivát kanamycinu U – Amikacin – jeho acetylace schopný cukerný
zbytek je blokován hydroxybutyratovou skupinu – i přes to již došlo k
evoluci nové N-Acetyl transferázy, která je schopna acetylovat tuto
molekulu
Resistence vůči tetracyklinu
• Tetracyklin se váže na 16S rRNA a inhibuje translaci
• Inhibuje prokaryotickou i eukaryotickou translaci (eukaryota
ho aktivně neimportují, spíše naopak, efektivně ho exportují)
• Resistence:
• Plasmid R kódující transporter, který umožnuje efektivní export
tetracycklinu zpět do prostředí
Ti plasmids
• Tumor-inducing (Ti)
• Přenos mezi baktérií a rostlinou
• Ti plasmid se nachází v baktérii
Agrobacterium
• Část plasmidu je přenesena do
rostlinné buňky pomocí
procesu připomínající konjugaci
• Dojde k začlenění
(náhodnému) do chromozómu
a k expresi růstových hormonů
– nádor a místo pro množení
baktérie
Ti plasmid
• T oblast plasmidu obsahuje
geny pro auxin (zvětšuje objem
buňky), cytokin (indukuje
replikaci buňky) a opin (zdroj
energie pro bakéterii)
• Ti plasmid může vstoupit také du
kvasinkové a savčí buňky (v
laboratoři)
• Použití v genovém inženýrství
• Arabidopsis thalianna – 27 000
genů přerušeno pomocí Ti
plasmidu – inaktivace genu –
studium fenotypu
2 plasmid kvasinek
• Kruhová molekula 6318bp (dsDNA)
• 50-100 kopií/haploidní genom
• Nachází se v jádře!, váže histony a
formuje nukleozóm
• Použítí v genovém inženýrství –
eukaryotický klonovací vektor
• Skladba:
• 2 obrácené repetice (rozdělují plasmid
na 2774 a 2346bp)
• Flp rekombináza (flippase) katalyzuje
rekombinace, rozeznáva Frt místo
• Může dojít k inzercím, či delecím daných
segmentů pokud jsou ohraničeny Frt
místy
• Flp/Frt systém je podobný Cre/loxP
systému
Replikace lineárních
chromozómů - telomery
• Problém při replikace lineárních
chromozómů
• DNA polymeráza potřebuje primer
• Po odstranění RNA primeru dojde ke
zkrácení DNA
• Buněčné hodiny
• Telomery
• OPAKOVANÉ KRÁTKÉ SEKVENCE (20STOVKY), OBVYKLE 6 BÁZÍ
• TTAGGG – OBRATLOVCI
• TELOMERASE – PRODLOUŽÍ KONCE
DNA O JEDEN TANDEM
• PROTEKCE PROTI EXONUKLEAZOVÉ
AKTIVITĚ
• EXTRÉMNĚ KONZERVOVANÉ
Replikace lineárních
chromozómů
• Protein primery
• DNA polymeráza může použít
volnou –OH skupinu z proteinu
• Systém používán některými viry a
bakterií rodu Streptomyces
(lineární chromozóm)
Replikace lineárních
chromozómů
• Mnoho počátků replikace (10 000 až 100 000 u dělící se somatické
buňky)
• Obousměrná
• Replikační bublina
• Synchronizace
• každý chromozóm je replikován pouze jednou
• každý počátek prochází iniciací pouze jednou
Počátek replikace
• Nejlépe studován u kvasinek
• ORC komplex (origin recognition
complex) se váže na na počátek
replikace a spouští řadu reakcí:
• Cdc6, Cdt1 a ORC a MCM (helicase)
= pre-replicative complex (pre-RC)
• Tento komplex se formuje pouze v
G1 fázi
• Pre-RC je aktivován kinázou S-CDK
a aktivuje Sld2 a Sld3
• Sld2 a Sld3 se váže na Dpb11 a ten
přináší cdc45a DNAP 
• Pre-loading complex, pre-LC
Syntéza eukaroytické DNA
•
•
•
•
Stejný princip jak u baktérií
Komplikovanější
MCM – minichromosome maintenance
DNAP  , , 
• DNAP  - primase – iniciace replikace, syntetizuje
primer, který pak prodlužuje pomocí dNTPs – 20nt
– iDNA
• RPA A – replication protein A – chrání ss
• RFC – replication factor C – váže se na iDNA,
přibírá do komplexu posuvnou svorku (PCNA
protein) + 2 DNAP
• DNAP  - přepisuje opožďující se vlákno
• DNAP  - přepisuje vedoucí vlákno
• PCNA protein je trimer
• Regulatory proteiny – Cdc45, GINS complex –
neznámá funkce
• Primery jsou odstraněny pomocí exonukleázy
Fen1 a/nebo Dna2 (rozdíl oproti baktériím)
• Mezery jsou dosyntetizovány DNAP  a spojeny
pomocí DNA ligázy
Rodiny DNA polymeráz
Family
Příklad
Funkce
A
Bakteriální DNAP I
Odstraňuje RNA primer z opožďujícího
se vlákna
B
Eukaryotní DNAP ,,
Hlavni polymerázy pro replikaci
C
Bakteriální DNAP III
Hlavni polymeráza pro replikaci
D
PolD polymerase
Replikace u Archeií
X
Eukaroytní DNAP β
Reparační enzym
Y
Bakteriální polymerase V
Reparační enzym v SOS systému
RT
Reverzní transkriptáza a
telomeráza
Vytváří DNA z RNA templátu
PCR
• Polymerázova řetezcová reakce
• Umožňuje namnožení DNA z velmi malého množství
PCR
• Polymerázova řetezcová reakce
• Komponenty PCR reakce jsou:
•
•
•
•
PCR primery
DNA polymerase (from Thermus aquaticus)
dNTPs
PCR instrument
PCR
• Polymerázová řetězová reakce
• Cyklus:
•
•
•
•
90°C – denaturace
50°C – 60°C – nasedání primerů
72°C – elongace
90°C – denaturace
30x
PCR
• Polymerázová řetězová reakce
• 2. cyklus
PCR
• Polymerázová řetězová reakce
• 3. cyklus
PCR
• PCR primers
• Primer design
• Degenerativní primery
• Přidání restrikčních míst
Inverzní PCR
• Sekvenování neznáme sekvence
kolem známé
• Štípnutí DNA restrikčním enzymem
(nesmí štípat ve známé sekvenci)
• Vytvoření kruhovité molekuly
• PCR
• Sekvence
RT PCR
• Složitá manipulace s geny obsahující
exony
• mRNA již obsahuje sekvenci, která je
translatovatelná
• Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z
retrovirů) vytvoření DNA z mRNA
• Vytvoření jednoho vlákna cDNA –
templátová DNA
• Studium exprese genů
RACE – rapid amplification of
cDNA ends
• Celou délku cDNA jednoho
genu je občas složité získat
• Nedostatečné množství
cDNA pro další experimenty
• Na 5‘ konci bývají
sekundární struktury
• RACE generuje kompletní
konce 5‘ a 3‘ ve dvou
produktech
• Na rozdíl od RT PCR, primer
obsahuje ukotvující
sekvenci
Directed mutagenesis
• Umožňuje změnu sekvence
• Substitute, delece či inzerce
aminokyselin
• Původní plasmidová DNA
izolovaná z baktérií je
methylována
• Nová pomocí PCR vytvořená
plasmidová DNA není
methylována
• Restrikce za použití enzymu,
který štípe pouze
methylovanou sekvenci
• Transformace pouze nově
vytvořeného plasmidu
Pojmy, které jsou důležité k
zapamatování
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Horizontální a vertikální přenos genů
Replikace
Vedoucí a opožďující se vlákno
Replikační vidlička
Replisom
Semi-konzervativní replikace
Obousměrná replikace
DNA gyráza
Topoisomeráza IV
DNA polymeráza vs. RNA polymeráza
RNA primer vs iDNA
SSB proteiny
NTP vs dNTP
 replikace
Primáza
Syntéza dNPTs a enzymy účastnící se
DNA polymeráza I, II, III
DNA polymeráza ,,
Proofreading, mismatch
Okazakiho fragmenty
DNA ligáza
Počátek replikace
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ter místa, terminus
Telomera, telomeráza
Eukaryotická replikace vs. Prokaryoticá
MCM, PCNA protein, pre-RC a pre-LC komplexy
Plasmid
Copy number
Replikace valivou kružnicí
Mobilita vs transferabilita
Antibiotika a resistence
CoEl plasmid
R plasmid
Ti plasmid
2 plasmid
Flipáza a frt místo
PCR
RT PCR
RACE
Inverzní PCR
mutageneze

similar documents