Καλλιεργητικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των Gram αρνητικών

Report
ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΤΙΚΑ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ GRAM(-) ΚΟΚΚΩΝ
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ-ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ
Ομιλήτρια: Γεωργία Καγκάλου
Ειδικευόμενη Ιατρικής Βιοπαθολογίας ΝΕΠΘ
Συντονίστρια: Δρ. Αθηνά Κανσουζίδου
GRAM(-) ΚΟΚΚΟΙ ΜΕ ΙΑΤΡΙΚΟ
ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝ
 Neisseria meningitidis
 Neisseria gonorrhoeae
 Moraxella catarrhalis
 Eikenella corrodens
 Kingella kingae
N. meningitidis
• Είναι απαιτητικός μικροοργανισμός
• Αναπτύσσεται καλύτερα σε θρεπτικά υλικά
εμπλουτισμένα με αίμα μετά από επώαση στους 35-37°C
και ατμόσφαιρα 2-5% CO2 για 18-24 ώρες
• Απομονώνεται συνήθως από το ΕΝΥ ή από το αίμα
• Η καλλιέργεια του ΕΝΥ στα θρεπτικά υλικά πρέπει να
γίνεται αμέσως, διότι ο μηνιγγιτιδόκοκκος δεν επιβιώνει
σε θερμοκρασία δωματίου
Μηνιγγιτιδόκοκκος-Θρεπτικά υλικά
Αιματούχο άγαρ
• Ως βάση χρησιμοποιείται ένα καλό θρεπτικό
άγαρ, όπως Columbia agar, Trypticase soy
agar, Brucella agar, Brain heart infusion agar,
Mueller-Hinton agar
• Προστίθεται 5% απινιδωμένο αίμα προβάτου
ή κονίκλου ή αλόγου ή ανθρώπου
Μορφολογία αποικιών N.meningitidis στο
αιματούχο άγαρ
Άχρωμες έως γκρι, χωρίς αιμόλυση, στρογγυλές,
λείες, υγρές, γυαλιστερές έως περλέ και κυρτές με
σαφώς καθορισμένα όρια
Σοκολατόχρωμο άγαρ
Προέρχεται από το αιματούχο άγαρ, που έχει θερμανθεί
στους 80°C, πλούσιο σε αυξητικούς παράγοντες, όπως
NAD και αιμίνη
Οι αποικίες στο σοκολατόχρωμο άγαρ είναι μεγάλες,
άχρωμες έως γκρι και αδιαφανείς
Υλικό Levinthal
Προέρχεται από το αιματούχο άγαρ, το οποίο έχει
θερμανθεί μέχρι βρασμού. Με το βρασμό το αίμα πήζει
σε αδρές κροκίδες, τα πήγματα καθιζάνουν και το
διαυγές υπερκείμενο διαχωρίζεται
Οι αποικίες στο Levinthal είναι γκριζωπές,
γυαλιστερές και κατά την ανάπτυξή τους δεν
προκαλούν μεταβολή του θρεπτικού υλικού
Θρεπτικός ζωμός
• Χρησιμοποιείται ένας πλούσιος θρεπτικός
ζωμός, όπως ο θειογλυκολικός, στον οποίο
προστίθεται γλυκόζη 1g/dl
• Μετά από επώαση γίνεται ανακαλλιέργεια σε
θρεπτικά υλικά
• Ο ζωμός έχει διπλό σκοπό, εκτός από
εμπλουτισμό, αραιώνει και την αντιμικροβιακή
δράση του ENY
Αιμοκαλλιέργεια
Αιμοκαλλιέργεια πρέπει να γίνεται σε όλες τις
περιπτώσεις μηνιγγίτιδας, για διαπίστωση
μηνιγγιτιδοκοκαιμίας.
Ως θρεπτικό υλικό για τις αιμοκαλλιέργειες
χρησιμοποιείται πλούσιος θρεπτικός ζωμός
• Ζωμός σόγιας και τρυπτικάσης (Trypticase Soy
Broth, TSB)
• Ζωμός με τρυπτόνη (tryptose broth)
• Θειογλυκολικός ζωμός (THIOL)
• Ζωμός με εκχύλισμα εγκεφάλου και καρδιάς
(Brain Heart Infusion Broth)
ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ
• Βιταμίνες, αιμίνη, κυστίνη, νικοτιναμίδη (NAD)
ευνοούν την ανάπτυξη μικροβίων
• SPS (Sodium Polyanethol Sulfonate ) προστίθεται
για ενίσχυση των ζωμών και έχει τις εξής ιδιότητες:
 Aναστέλλει την πήξη του αίματος μέσα στο ζωμό
 Aναστέλλει τη φαγοκυτταρική δράση του αίματος
 Aδρανοποιεί το συμπλήρωμα
 Mειονέκτημα: δυνατόν να αναστείλλει την
ανάπτυξη ορισμένων στελεχών ναϊσσερειών, η
δράση αυτή εξουτερώνεται με την προσθήκη
μικρής ποσότητας ζελατίνης
Αιμοκαλλιέργεια
Σύστημα Bactec
• Θρεπτικό υλικό: ζωμός σόγιας-καζείνης, με εκχύλισμα
ζύμης και προσθήκη αμινοξέων και βιταμινών
• Ανάγνωση αποτελέσματος: μετρά το ποσό του CO2, που
εκλύεται από το μεταβολισμό του μικροβίου με ειδικό
μετρητή βαθμολογημένο, με τεχνολογία LED.
Θετική αιμοκαλλιέργεια: για την απομόνωση του
μικροβίου γίνεται εμβολιασμός σε κατάλληλα θρεπτικά
υλικά
Καλλιέργεια Ρινοφαρυγγικού
επιχρίσματος
• Για την απομόνωση του μηνιγγιτιδοκόκκου σε
μηνιγγίτιδα, ιδιαίτερα όταν χορηγούνται
αντιβιοτικά και η καλλιέργεια του ΕΝΥ και του
αίματος είναι αρνητική
• Για την διαπίστωση μικροβιοφορίας
• Εμβολιάζεται σε αιματούχο, σοκολατόχρωμο
και Levinthal άγαρ
Υλικό μεταφοράς και
συντήρησης
(Stuart ή Amies)
Οι ναισσέρειες διατηρούνται για πάνω από 3 ημέρες
 Η έλλειψη πηγής αζώτου στο υλικό αποκλείει
συνήθως την πιθανότητα πολλαπλασιασμού
 Αντιθέτως η άφθονη ποσότητα υδατάνθρακος
εξασφαλίζει επαρκή προμήθεια ενέργειας και
παρατείνει την επιβίωση των μικροβίων
 Η σύνθεση του υλικού εξασφαλίζει σταθερό Ph
7,4+/-0,2.
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ
ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΟΚΟΚΚΟΥ
• Μετά την ανάπτυξη στα θρεπτικά υλικά
και τη χαρακτηριστική εμφάνιση των
αποικιών
•Γίνεται επιβεβαίωση ότι πρόκειται για
μηνιγγιτιδόκοκκο
• Παρασκεύασμα από την ανάπτυξη, χρώση
Gram, μικροσκοπική εξέταση
• Έλεγχος διαφόρων βιοχημικών ιδιοτήτων του
μικροβίου
Απαιτείται επίπεδο βιοασφάλειας 2 (BSL-2)
ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ
Για τη διαπίστωση της μορφολογίας του μικροβίου,
από τις αποικίες γίνονται παρασκευάσματα με
φυσιολογικό ορό επάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα,
τα οποία βάφονται κατά Gram και εξετάζονται στο
μικροσκόπιο
Ο μηνιγγιτιδόκοκκος εμφανίζεται ως Gram(-)
διπλόκοκκος
Άμεσο παρασκεύασμα - Χρώση Gram
• Χαρακτηριστική μορφολογία Gram(-)
διπλοκόκκων σε σχήμα καφέ-φασολιού,
ενδοκυτταρίως στα πολυμορφοπύρηνα ή
εξωκυτταρίως
• Είναι δυνατόν να διακρίνεται και το έλυτρο
ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ N.meningitidis
ΔΕΙΓΜΑ
ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
ΑΠΟΙΚΙΕΣ (ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ)
GRAM ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ
ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ
ΚΑΤΑΛΑΣΗ(+)
ΟΞΕΙΔΑΣΗ(+)
ΟΞΕΙΔΑΣΗ(-) ΌΧΙ N.meningitidis
ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΔΙΑΣΠΑΣΗΣ ΣΑΚΧΑΡΩΝ
(-) ΟΧΙ N.meningitidis
ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΟΞΕΩΣ ΣΕ ΓΛΥΚΟΖΗ, ΜΑΛΤΟΖΗ
ΌΧΙ ΣΕ ΣΟΥΚΡΟΖΗ, ΛΑΚΤΟΖΗ
ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΑΝΤΙΟΡΟΥΣ
ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ,
ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ
ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ
Δοκιμασίες ταυτοποίησης
Δοκιμασία Καταλάσης
Καταλάση: ένζυμο που διασπά το υπεροξείδιο
του υδρογόνου σε νερό και μοριακό οξυγόνο,
που εκλύεται υπό μορφή φυσαλίδων
Αντιδραστήριο: πρόσφατο υδατικό διάλυμα (έως
5 ημερών), υπεροξειδίου του υδρογόνου
(hydrogen peroxide 3%)
Εκτέλεση δοκιμασίας
Καταλάσης
•Μια αποικία του μικροβίου ανακατεύεται σε σταγόνα
του αντιδραστηρίου επάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα
• Παρατηρούμε για εμφάνιση φυσαλίδων
• Πιθανότητα ψευδώς θετικής δοκιμασίας, όταν το
υλικό στο οποίο αναπτύχθηκε το μικρόβιο είναι το
αιματούχο άγαρ
Δοκιμασία οξειδάσης
Το αντιδραστήριο της οξειδάσης (tetramethyl-ophenylenediamine dihydrochloride) μετατρέπεται
σε μωβ από τους μικροοργανισμούς που
περιέχουν το κυτόχρωμα C της οξειδάσης ως
μέρος της αναπνευστικής αλυσίδας τους.
•Τη δοκιμασία δίνουν θετική και άλλα μέλη του
γένους Neisseria
Αντιδραστήριο οξειδάσης
• Για την παρασκευή του αντιδραστηρίου
διαλύονται 0,1g σε 10 ml νερό αποσταγμένο
•Το διάλυμα πρέπει να παρασκευάζεται
καθημερινά και αυτό που δεν χρησιμοποιείται
απορρίπτεται
• Εναλλακτικά μπορεί να διανέμεται σε κλάσματα
του 1 ml και να αποθηκεύεται σε κατάψυξη στους
-20°C
Εκτέλεση δοκιμασίας
• Σε μία μη πορώδη επιφάνεια (τρυβλίο Petri ή
γυάλινη πλάκα) διαβρέχουμε μια λωρίδα διηθητικού
χαρτιού, με σταγόνες αντιδραστηρίου οξειδάσης
• Μια αποικία από το αιματούχο άγαρ τρίβεται επάνω
στο ποτισμένο με αντιδραστήριο διηθητικό χαρτί
• Αλλαγή του χρώματος σε ερυθρό-μωβ σε 10sec
• Με ενστάλαξη του αντιδραστηρίου επάνω σε
αποικίες του μικροβίου, οι οποίες παίρνουν ερυθρόμπλε-μωβ χρώμα (το μικρόβιο δεν μπορεί να
χρησιμοποιηθεί για ανακαλλιέργεια)
Δοκιμασία διάσπασης σακχάρων
• Χρησιμοποιούνται τα σάκχαρα γλυκόζη, μαλτόζη,
λακτόζη, σακχαρόζη
• Τα σάκχαρα προστίθενται σε σωληνάρια που
περιέχουν υλικό-βάση σε συγκέντρωση 1%
• Η βάση είναι το υλικό CTA
Υλικό CTA (Cystine trypticase agar)
• Περιέχει κυστίνη, καζείνη, άγαρ, χλωριούχο
νάτριο και θειώδες νάτριο
• Στο υλικό προστίθεται ως δείκτης το ερυθρό
της φαινόλης (κίτρινο χρώμα με την παρουσία
οξέος σε Ph 6,8 ή χαμηλότερο)
• Το υλικό διατηρείται στο ψυγείο στους 4°C
Εκτέλεση δοκιμασίας
• Ετοιμάζονται σωληνάρια (με 2ml υλικό) για τα
τέσσερα σάκχαρα
• Τα σάκχαρα προστίθενται σε αναλογία 1% ή
χρησιμοποιούνται χάρτινοι δίσκοι χωριστά για
κάθε σάκχαρο που βυθίζονται στο υλικό
• 3-5 αποικίες από το αιματούχο άγαρ
εμβολιάζονται στο κάθε σωληνάριο
• Επωάζονται τα σωληνάρια στους 35-37°C
χωρίς CO2
Δοκιμασία
σακχάρων
Θετική δοκιμασία: ανάπτυξη θολερότητας και
κίτρινου χρώματος στο ανώτερο τμήμα του
υλικού, η οποία υποδεικνύει ανάπτυξη των
βακτηρίων και παραγωγή οξέος
• Aρνητικά αποτελέσματα δεν πρέπει να
ερμηνεύονται πριν από 72 ώρες επώασης
ΠΙΝΑΚΑΣ ΔΙΑΣΠΑΣΗΣ ΣΑΚΧΑΡΩΝ
ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ
ΓΛΥΚΟΖΗ
ΜΑΛΤΟΖΗ
ΛΑΚΤΟΖΗ
Neisseria
meningitidis
+
+
_
_
Neisseria
gonorrhoeae
+
_
_
_
Neisseria
lactamica
+
+
+
_
Neisseria sicca
+
+
_
+
Moraxella
catarrhalis
_
_
_
_
N.lactamica
ΣΟΥΚΡΟΖΗ
Ορολογική ταυτοποίηση μηνιγγιτιδοκόκκου
Με βάση τον πολυσακχαρίτη του ελύτρου οι
μηνιγγιτιδόκοκκοι ταξινομούνται σε 13 οροομάδες:
A, B, C, D, H, I, K, L, X, Y, Z, W135 και 29E
Ένα μεγάλο ποσοστό στελεχών που ανακτώνται
από ρινοφαρυγγικούς μικροβιοφορείς είναι δυνατό
να μην εκφράζουν ανιχνεύσιμο αντιγόνο του
πολυσακχαριδικού ελύτρου, δηλαδή να μην είναι
δυνατή η κατάταξή τους σε οροομάδες
Ορολογική ταυτοποίηση μηνιγγιτιδοκόκκου
Οι μηνιγγιτιδόκοκκοι είναι δυνατόν να υποδιαιρεθούν:
• Σε 20 οροτύπους με βάση τα αντιγόνα των τάξης 2
και 3 OMP (PorB)
• Σε 10 υπο-οροτύπους με βάση τα αντιγόνα των
τάξης 1 OMP (PorA)
• Σε 13 ανοσοτύπους με βάση τη δομή του
λιποολιγοσακχαρίτη (LOS)
Ταυτοποίηση με αντιορούς
• Γίνεται εναιώρημα του μηνιγγιτιδοκόκκου σε Φ.Ο
• Προστίθεται μία σταγόνα αντιορού
• Γίνεται καλή ανάμιξη και ανακίνηση για 2 λεπτά
• Παρατήρηση για συγκόλληση μόνο σε έναν
αντιορό, ο οποίος καθορίζει την οροομάδα
Ψευδείς συγκολλήσεις:
• Παρατηρούνται σε περισσότερους αντιορούς
• Επανάληψη μετά ανακαλλιέργεια σε MH άγαρ
N.gonorrhoea
Για την απομόνωση του γονοκόκκου τα δείγματα
εμβολιάζονται στα κατάλληλα θρεπτικά υλικά και
επωάζονται σε θερμοκρασία 35-36,5οC, σε
ατμόσφαιρα CO2 5-10%
N.gonorrhoeae - Θρεπτικά υλικά
ΥΛΙΚΟ THAYER-MARTIN
Είναι ένα πολύ εμπλουτισμένο θρεπτικό υλικό στο
οποίο έχουν προστεθεί αντιβιοτικά, για την
αναστολή της ανάπτυξης άλλων σαπροφυτικών
μικροβίων που υπάρχουν στα δείγματα από την
ουρήθρα, τον τράχηλο της μήτρας, τον πρωκτό και
το φάρυγγα.
Σύνθεση του υλικού THAYER-MARTIN
•Ως βάση χρησιμοποιείται το GC Agar στο οποίο
προστίθεται βόειος αιμοσφαιρίνη, IsovitaleX
Enrichment και VCN inhibitor
• Η αιμοσφαιρίνη παρέχει τον παράγοντα Χ (αιμίνη)
• Το υλικό IsovitaleX παρέχει τον παράγοντα V (NAD),
βιταμίνες και άλλους παράγοντες που ευνοούν την
ανάπτυξη των ναϊσσερειών
•Το VCN inhibitor περιέχει τα αντιβιοτικά:
• βανκομυκίνη (αναστέλλει τα Gram(+) βακτηρίδια),
• κολιστίνη (αναστέλλει τα Gram (-) βακτηρίδια),
• νυστατίνη ( αναστέλλει τους μύκητες).
Μορφολογία αποικιών
στο THAYER-MARTIN
Οι αποικίες του γονοκόκκου στο Thayer-Martin
είναι μεγάλες, στρογγυλές, λείες, κυρτές,
άχρωμες έως γκρι, αδιαφανείς και η ανάπτυξή
τους δεν προκαλεί αποχρωματισμό του υλικού
MARTIN-LEWIS AGAR
Το υλικό, όπως το Thayer-Martin, χρησιμοποιείται
για την απομόνωση των ναϊσσερειών από
δείγματα με χλωρίδα βακτηρίων και μυκήτων
• Ως βάση χρησιμοποιείται το σοκολατόχρωμο
άγαρ, στο οποίο προστίθενται:
• IsovitaleX
• VCA Inhibitor (βανκομυκίνη, κολιστίνη,
ανισομυκίνη) και επιπλέον τριμεθοπρίμη
• Καζεΐνη, πεπτόνη, άμυλο καλαμποκιού
NYC Medium
(New York City medium)
Υλικό διαφανές και πολύ εκλεκτικό για την
απομόνωση του γονοκόκκου από δείγματα με χλωρίδα
• Ως βάση χρησιμοποιείται το GC agar, στο οποίο
προστίθενται:
•Αίμα αλόγου
• Το υλικό Yeast autolysate growth supplement,
το οποίο παρέχει κλάσματα ζυμοειδών μυκήτων,
με γλυκόζη και διττανθρακικό νάτριο
• Το υλικό VCAT, που περιέχει βανκομυκίνη,
κολιστίνη, αμφοτερικίνη Β και τριμεθοπρίμη
Χρώση Gram
Σε παρασκευάσματα από καλλιέργεια η
μορφολογία δεν είναι τυπική, ανευρίσκονται
Gram(-) καφεοειδείς κόκκοι, σε ζεύγη, μικρές
ομάδες ή και μεμονωμένοι
Άμεσο παρασκεύασμα από το πύο:
πιο χαρακτηριστική μορφολογία (ενδοκυτταρίως στα
πολυμορφοπύρηνα και εξωκυτταρίως)
ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ N.gonorrhoeae
ΔΕΙΓΜΑ
ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
36οC, CO2
ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΑΠΟΙΚΙΩΝ
GRAM ΑΠΟ ΤΙΣ ΑΠΟΙΚΙΕΣ
GRAM(-)
ΔΙΠΛΟΚΟΚΚΟΙ
ΑΛΛΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ
ΟΞΕΙΔΑΣΗ(+),ΚΑΤΑΛΑΣΗ(+)
ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΣΑΚΧΑΡΩΝ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ
ΔΙΑΣΠΑΣΗ
ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ
ΓΛΥΚΟΖΗΣ
ΘΕΤΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ
ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ
Ταυτοποίηση με αντιορό
• Η δοκιμασία γίνεται από αποικίες γονοκόκκου
• Το αντιδραστήριο περιέχει μονοκλωνικό
αντίσωμα, το οποίο ανιχνεύει την Por πρωτεΐνη
της εξωτερικής μεμβράνης
Δοκιμασία
ανοσοφθορισμού
•Το μονοκλωνικό αντίσωμα που είναι
προσροφημένο στη μικροπλάκα είναι σημασμένο
με ισοθειοκυανική φλουορεσκείνη και αντιδρά
ειδικά με τη N.gonorrhoeae (ειδικότητα 100%,
ευαισθησία 99%), καθώς δεσμεύεται με τις
πρωτεΐνες πορίνες της εξωτερικής μεμβράνης
Στο μικροσκόπιο φθορισμού η N.gonorrhoeae έχει
εικόνα φθοριζόντων διπλοκόκκων με σχήμα
νεφρού, σε χρώμα πράσινου μήλου
ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ
Τα στελέχη γονοκόκκου και μηνιγγιτιδοκόκκου
διατηρούνται:
• Σε ζωμό BHIB με 20% γλυκερόλη
• Σε απινιδωμένο αίμα προβάτου και άπαχο γάλα
10% με προσθήκη γλυκερόλης 15%
• Η διατήρηση γίνεται σε καταψύκτη στους -80°C ή σε
υγρό άζωτο στους -196°C, για μακρά χρονικά
διαστήματα
Moraxella catarrhalis
• Είναι αερόβια ή προαιρετικά αναερόβια. Οι αποικίες στο
αιματούχο άγαρ, μετά 24ωρη επώαση είναι μικρές,
χρώματος γκρι-λευκό, αδιαφανείς, λείες και στεγνές.
• Οι αποικίες στο σοκολατόχρωμο άγαρ έχουν χρώμα ροζκαφέ. Αναπτύσσεται επίσης στα υλικά Thayer Martin, Martin
Lewis και New York City.
Moraxella catarrhalis
• Μικροσκοπική εξέταση:Gram(-) διπλόκοκκος
• Kαταλάση θετική, οξειδάση θετική
• Aνάγει τα νιτρικά άλατα και παράγει DΝάση
• Είναι μη σακχαρολυτική
• Σε αντίθεση με τις ναϊσσέρειες δίνει θετική την
δοκιμασία υδρόλυσης της τριβουτυρίνης, διότι παράγει
το ένζυμο βουτυρική εστεράση
Δοκιμασία αναγωγής νιτρικών αλάτων
• Σε θρεπτικό ζωμό, ο οποίος περιέχει
νιτρικό κάλιο προστίθενται 2-3 αποικίες
• Επώαση και προσθήκη αντιδραστηρίων
•Τα αντιδραστήρια αντιδρούν με τα
νιτρώδη άλατα, για σχηματισμό ερυθρής
ένωσης (p-σουλφο-βενζόλιοαζωαναφθυλαμίνη), η παρουσία της
οποίας υποδεικνύει των αναγωγή των
νιτρικών αλάτων σε νιτρώδη
Παραγωγή DNάσης
• Η DNάση είναι ένζυμο, που διασπά το DNA
• Η δράση της DNάσης μπορεί να ανιχνευτεί με
εμβολιασμό σε DNάση άγαρ
• Μετά από 24ωρη επώαση η υδρόλυση του
DNA ανιχνεύεται από την αλλαγή στο χρώμα
του υλικού από μπλε σε ροζ, γύρω και κάτω
από την περιοχή του ενοφθαλμισμού
Οι ναϊσσέρειες σε αντίθεση με τη Moraxella
δίνουν την αντίδραση αρνητική
Eikenella corrodens
ΧΡΩΣΗ GRAM
• Η Eikenella corrodens και η Kingella kingae
αποτελούν συγγενή είδη των ναϊσσερειών
• Αποικίζουν το στοματοφάρυγγα του ανθρώπου
και είναι ευκαιριακά παθογόνα
Η E.corrodens είναι καταλάση αρνητική,
οξειδάση θετική και ανάγει τα νιτρικά άλατα
Kαλλιεργητικές ιδιότητες
Eikenella corrodens
Αναπτύσσεται σε αιματούχο
και σοκολατόχρωμο άγαρ
Oι αποικίες μετά 48ωρη επώαση στους 37οC σε CO2 5-7%
είναι μικρές, διαμέτρου 0,5-2 mm, έχουν χρώμα γκριζωπό
και έχουν χαρακτηριστικό άρωμα χλωρίνης
Πολλά στελέχη έχουν χαρακτηριστική εμφάνιση
σκασίματος ή διάβρωσης της επιφάνειας του υλικού.
Kingella kingae
• Είναι καταλάση (-), οξειδάση (+)
• Προκαλεί διάσπαση της γλυκόζης και της
μαλτόζης με παραγωγή οξέος
Στο αιματούχο άγαρ προκαλεί αιμόλυση
Οι αποικίες μετά 48ωρη επώαση στο αιματούχο
άγαρ στους 35-37°C σε CO2 5-10% είναι μικρές,
λείες, με σαφή άκρα και προκαλούν σκάσιμο της
επιφάνειας του υλικού
ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ
• Η αντιμετώπιση της λοίμωξης επιτυγχάνεται με τη
χορήγηση αντιβιοτικού
• Για τη δοκιμασία ευαισθησίας στα αντιβιοτικά
απαιτητικών μικροοργανισμών, όπως οι ναϊσσέρειες
χρησιμοποιείται το Mueller-Hinton agar
Στο υλικό μπορεί να προστεθεί 5% αίμα προβάτου ή
αλόγου
Μέθοδος των δίσκων κατά Kirby-Bauer
Τεχνική
 Παρασκευάζεται το εναιώρημα του μικροβίου
Το άγαρ ενοφθαλμίζεται 3 φορές προς όλες τις
κατευθύνσεις, ώστε να εξασφαλιστεί η ομοιόμορφη
κατανομή του εναιωρήματος
Τεχνική της μεθόδου Kirby
Bauer
Ως αποτέλεσμα ενός αντιβιογράμματος
Με αποστειρωμένη λαβίδα ή με την ειδική
ο μικροοργανισμός χαρακτηρίζεται
συσκευή τοποθετούμε τους δίσκους των
ευαίσθητος, ανθεκτικός ή ενδιάμεσης
αντιβιοτικών
ευαισθησίας
Η μέτρηση της ζώνης ευαισθησίας γίνεται με τη
χρήση χάρακα
Αντιβιόγραμμα σε αυτόματο
μηχάνημα
• Μικρομέθοδος αραιώσεων σε ζωμό
• Μετρά MIC (Minimum Inhibitory
Concentration)
• Πλάκες μικροτιτλοποίησης με
υποδιπλάσιες αραιώσεις αντιβιοτικών
• Ανάγνωση του αποτελέσματος με
αυτοματοποιημένα συστήματα (VITEC)
MIC είναι η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού,
που αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροβίου
Άλλες μέθοδοι υπολογισμού MΙC:
• Μέθοδος αραίωσης αντιβιοτικών σε άγαρ
• Μέθοδος κλιμακωτής διάχυσης (E-test)
ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ
Ο οργανισμός CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute) στις ΗΠΑ
Η επιστημονική επιτροπή EUCAST (European
Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing) έχει συσταθεί από την Ευρωπαϊκή
Εταιρεία Κλινικής Μικροβιολογίας και
Λοιμώξεων (ESCMID)
ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ
Τα αντιβιοτικά που επιλέγονται για το
Μηνιγγιτιδόκοκκο περιλαμβάνουν απαραίτητα
τις κατηγορίες των πενικιλλινών και των
κεφαλοσπορινών
 Για το Γονόκοκκο επιλέγονται η πενικιλλίνη
(αποτελεί το αντιβιοτικό εκλογής) και οι
κεφαλοσπορίνες
ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ
Πολλά στελέχη Moraxella παράγουν β-λακταμάση.
Το EUCAST προτείνει αντιβιοτικά από τις κατηγορίες
των πενικιλινών, των κεφαλοσπορινών, των
αμινογλυκοσιδών και άλλα αντιβιοτικά
Η Kingella είναι ευαίσθητη στα αντιβιοτικά
πενικιλλίνη, αμπικιλλίνη και ερυθρομυκίνη
 Η Eikenella είναι ανθεκτική στη κλινταμυκίνη και
ευαίσθητη στην αμπικιλλίνη και 3ης γενεάς
κεφαλοσπορίνες
Το CLSI προτείνει 12 αντιβιοτικά για το Μηνιγγιτιδόκοκκο και 23 για το
Γονόκοκκο, για τα οποία δίνει διάμετρο της ζώνης αναστολής και MIC
ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟΥ
N.meningitidis
ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ
Πενικιλίνες
Πενικιλλίνη, Αμπικιλλίνη
Κεφαλοσπορίνες
Κεφοταξίμη, Κεφτριαξόνη
Καρβαπενέμες
Μεροπενέμη
Μακρολίδες
Αζιθρομυκίνη
Τετρακυκλίνες
Μινοκυκλίνη
Κινολόνες
Ναλιδιξικό οξύ
Φλουορο - κινολόνες
Σιπροφλοξασίνη
Αναστολείς φυλικού
Τριμεθοπρίμη - Σουλφομεθοξαζόλη
Άλλοι παράγοντες
Χλωραμφενικόλη, Ριφαμπικίνη
ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟΥ
N.gonorrhoae
ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ
Πενικιλίνες
Πενικιλλίνη G
Κεφαλοσπορίνες
Κεφοταξίμη, Κεφοξιτίνη, Κεφεπίμη
Αλλοι παράγοντες
Σιπροφλοξασίνη, Τετρακυκλίνη
Το EUCAST προτείνει 18 αντιβιοτικά για το
Μηνιγγιτιδόκοκκο και 27 για τον Γονόκοκκο, για τα οποία
δίνει MIC
ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ
(N.meningitidis)
ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ
Πενικιλίνες
Βενζιπενικιλλίνη, Αμπικιλλίνη, Αμοξικιλλίνη
Κεφαλοσπορίνες
Κεφοταξίμη, Κεφτριαξόνη
Καρβαπενέμες
Μεροπενέμη
Άλλοι παράγοντες
Σιπροφλοξασίνη, Ναλιδιξικό οξύ
ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ (N.gonorrhoeae)
ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ
Πενικιλίνες
Αμπικιλλίνη, Αμοξυκιλλίνη
Κεφαλοσπορίνες
Κεφτριαξόνη, Κεφιξίμη
Άλλοι παράγοντες
Σιπροφλοξασίνη, Ναλιδιξικό οξύ
Σας ευχαριστώ
πολύ

similar documents