实验(出凝血检查) - 上海交通大学医学院医学检验系

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实验
出凝血检查
上海交通大学医学院
余文红
(一)血标本的采取应
注意的问题
1. PT、APTT凝血实验检查均使用静脉
血。采血人员应技术熟练,以防止
组织损伤,外源性凝血因子进入针
管。
2.一般血液采集,进入容器至进行实
验所用的时间越短,所分析的凝血
因子被保护得越好。从输液三通管
取出血的做法不可取。
3.取血时病人应松驰,环境温暖,防
止静脉挛缩,止血带的压力要尽可能
小,取血时,拉针栓的速度要慢而均
匀,使血液平稳地进入注射器,防止
气泡的产生。
4.一旦取样完毕,立即与抗凝剂充分
混合,一般提倡使用真空采血管。
5.用硅化玻璃或塑料注射器采血。考
虑结果的精确性,应将试管刻度的
可能误差控制在既定体积的10%以内。
6.采血后标本在低温保存且在一定时间范
围内。
7. 国际血液学标准化委员会(ICSH)、
国际血栓与止血委员会(ICTH)推
荐使用3.2g/dl(含2H2O)或
0.109mol/L的枸橼酸钠作为凝血因
子检查的抗凝剂。
8.抗凝剂在血标本的绝对含量可改
变血浆中钙离子浓度,进而影响试
验结果,因此应根据患者红细胞比
例(Hct)状况随时调整抗凝剂用量。
(二)应用试剂应注意
的问题
1.组织凝血活酶工作制剂的国际敏感
指数(ISI),为了使不同敏感性的
组织凝血活酶在检测PT中能得到同
样的结果,必须要制定一个共同的
敏感性指标。
2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使
用步骤必须严格按照说明书进行。
通常在使用前必须充分混匀试剂,
以使微粒重新均匀悬浮于液体中。
3.试剂准备过程中应该使用去离子水。
4.正常对照血浆通常将多份健康人血
标本混在一起,以弥补个体误差。
(三)使用实验器材应注意
的问题
1. 玻璃器皿的要求:贮存和测试时应
选用干净、没有划痕的试管。
2. 温度的要求:人工测定终点法要求
水浴箱的温度必须保持在(37±1)
℃,并且周围照明设备要好,便于
读取终点。
(四)实验操作应注意的问题
1. 许多试验误差都来源于技术的错误。
在实验技术、试剂、温度及pH值上
很微小的变化都会导致试验结果明
显的变化。
2. 手工法PT或试管法CT检查时,倾斜
试管动作一定要轻,角度要小,以
减少血液与管壁的接触面积。
3. 血液凝固主要是酶催化的反应,所
以实验过程中要严格控制理想的pH
环境和溶液的离子强度。
4. 试验结果准确还取决于所用的反应
物的量、加入顺序和不同反应物的
孵育时间。
5. APTT、PT需乏血小板血浆。
6. 试验前检查血浆是否有溶血、黄疸、
脂血和出现凝块。





7. 报告方式:
以PT的秒(s)数报告。
以患者PT(s)/正常对照(s)的比
(PTR)报告。
在口服药物治疗监控时以INR报告。
ICSH规定,不再用百分比(活动度)
报告。
APTT以秒报告。
1987年WHO提出PT值用INR
(international normalized ratio国
际标准化比值)作为PT结果报告形式,
并用以作为抗凝治疗监护的指标。
INR=[病人PT(s)/正常人平均PT
(s)]ISI
PTR=受检者PT(s)/正常对照PT(s)
INR=PTRISI
ISI:国际敏感指数
(international sensitivity
index)1~1.9
CT、PT、APTT、
RT、Fg、TT
凝 血 时 间 测 定
C T
目的:掌握玻璃试管法凝血时
间测定的方法
原理:
离体静脉血与玻璃表面接触后,
血中XII因子活化并启动内源性凝
血途径,最终生成纤维蛋白而使血
液凝固所需的时间。
器材:

6mm直径玻璃试管3支

静脉采血器材

37℃恒温浴箱

秒表
步骤:3支试管各1ml血,每隔0.5min倾
斜,第一管计时后,立即观察第二、三
管并计时,直至血液凝固。
结果判断:从血液刚进入注射器至第3管
凝固所需时间即为凝血时间。

正常参考值:4~12分钟

报告方式:CT
X.Xmin(玻璃试管法)
注意事项:

试管应洁净干燥,抽血应“一针见
血”且血液中不含泡沫。

温度恒定为37℃,倾斜试管角度应
在30°左右。
评价:



凝血时间曾用玻片法测定,但由于
毛细血管采血,易混入组织液而使
凝血时间正常,属于淘汰方法。
延长:严重内源性凝血途径凝血因
子有缺陷;血中抗凝物质增多;肝
素治疗
缩短:高凝状态(DIC早期)
凝 血 酶 原 时 间
P T
原理:
在乏血小板血浆中加入组织因
子和钙离子(钙凝血活酶)后,血
浆发生凝固的时间即为凝血酶原时
间(PT)。
步骤:




取空腹静脉血1.8ml加入含有
0.2ml109mmol/L枸橼酸钠的试管中
混匀备用。
抗凝血以3000r/min离心10min分离
血浆
将试剂、正常人混合血浆、待测血
浆与37℃预热5min。
血浆0.1ml加入混匀的试剂0.2ml,
开动秒表计时。
正常参考值:

PT:11~13秒

PTR:1±0.15

INR:0.8~1.5
报告方式:

PT:X.Xs,正常人血浆X.Xs

PTR:X.X

INR:X.X
注意事项:



试管应洁净干燥,抽血应“一针见
血”,抗凝剂与血液比例(1:9)
应准确。取血后4h内完成测定。
钙凝血活酶必须标有国际敏感指数
(ISI),ISI越接近于1.0越敏感。
标本测定前应先测定正常人混合血
浆,其PT值在允许范围内才能测定
样本。
评价:
血浆凝血酶原是一种筛选试验,是用
来证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶
原和凝血因子V、VII、X的缺陷或相应抑制物
的存在,也用于监测口服抗凝治疗时引起的
凝血酶原和因子VII、X水平的下降。
实质:
对检测样本(血浆)中存在凝血激
酶时的再钙化反应,这种过程包括了因子
VIIa、组织因子、磷脂、钙离子对凝血酶
原的活化,凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维
蛋白单体的聚集交联。
活化部分凝血活酶时间
测定
APTT
原理:
用白陶土激活XII因子、脑磷
脂代替血小板磷脂,测定乏血小
板血浆加入Ca2++后凝固所需时间。
步骤:





采血 空腹静脉血1.8ml+0.2ml 109mmol/L枸
橼酸钠混匀。
分离血浆 3000r/min离心10分钟分离血浆。
溶解试剂 临用时加1ml蒸馏水,室温静置
15min以上,混匀后使用。
预温活化 0.1ml血浆+APTT试剂0.1ml混匀,
37℃准确孵育3min(其间轻轻摇动数次)
加钙计时 加入0.1ml 25mmol/L CaCl2混匀并
立即开动秒表计时,20s后,观察混合液流动
状态。


正常参考值:一般在33.68~40.32s
(不同仪器和试剂所测之参考值有
差别)
报告方式:
APTT:XX.Xs,正常人血浆:XX.Xs
注意事项:




采血时穿刺尽量一针见血,不要淤血和
气泡,采血后立即与抗凝剂混合,尽快
送往实验室。使用枸橼酸盐(抗凝)血
浆
如果不能立即测试,应尽快分离血浆,
盛血浆的容器加塞,防止PH值改变
血浆在2~8℃下保留7天
钙凝血活酶必须标有国际敏感指数
(ISI),ISI越接近于1.0越敏感。
临床意义:
APTT延长:
 表明有内源性凝血途径有关因子的缺陷
(血友病)和纤维蛋白原缺乏。
 纤维活力增加,如继发性,原发性纤
溶以及血循环中有纤维蛋白(原)降解
产物(FDP)。
 血循环中有抗凝物质。
APTT缩短:
 高凝状态,如DIC的高凝期,促凝
物质进入血液以及凝血因子的活性
增高等。
评价:

APTT和PT同时检测是目前二期止血缺陷
的主要筛选试验组合。
在有临床出血症状的前提下:
APTT
正常
延长
正常
延长
PT
提示
延长
因子VII的缺陷
正常 因子VIII、IX、XI缺陷
正常 怀疑因子XIII缺陷可能
延长 除因子II、V、I、X缺陷
外,主要是异常抗凝物质
的增多
血浆复钙时间
RT
原理:
在去钙离子的抗凝血浆中,重
新加入适量的钙后,血浆发生凝固。
步骤:

0.2ml 0.1mol/L草酸钠+静脉血
1.8ml混匀,离心分离血浆。

0.1ml血浆置37℃水浴中,
+0.025mol/L CaCl2 0.1ml,立即开
动秒表记录时间。
正常参考值:
2.08±0.49分(2.18~3.77分钟)
注意事项:



不要溶血,否则时间缩短
CaCl2新鲜配制
分离血浆以1000转/分为宜,高速离
心可使大量血小板下沉而导致复钙
时间延长。
复钙交叉时间
RT
步骤:
按下列比例准备5份待测血浆:
加样量
1
2
3
4
5
受检血浆(ml)- 0.01 0.05 0.09 0.10
正常血浆(ml)0.10 0.09 0.05 0.01 -
上述试管,置37℃ 1min,加0.025mol/LCaCl2
0.1ml,混匀后,记录血浆凝固时间。
注意事项:

所用血浆均为富含血小板血浆,分离
出血浆后需在2h内检测完毕。
临床意义:

RT最早作为内源性凝血系统相关凝血因
子缺陷的筛选检查,但由于这个试验不
如APTT,又容易受血小板数量和功能影
响,目前只用来筛选是否存在病理性抗
凝物质增多。

延长的复钙时间如被1/10量的正常
血浆所纠正,则表示受检血浆中缺
乏内源凝血因子;如不被少量正常
血浆纠正,提示存在异常抗凝物质。
血浆纤维蛋白原
Fg
纤维蛋白原的测定方法众多,大体上分三大
类:

基于经加凝血酶后,形成纤维蛋白的方法,即
可凝固蛋白法。

物理、化学测定法。

免疫学测定法。
目的和原理
为了解凝血途径最后环节的状况,
排除纤维蛋白原减少、异常对凝血筛选
试验的影响,了解纤溶活动度等可选择
本试验。
Clauss法以凝血酶作用于受检血
浆中的纤维蛋白原,使其形成纤维蛋
白,血液凝固。
纤维蛋白原的量与凝固时间成负
相关,检测结果与参比血浆制成的
标准曲线对比可得出纤维蛋白原的
含量。
步骤:


将参比血浆用血浆稀释液作原倍、1:2、1:4、
1:8、1:16稀释5管。
取稀释血浆0.2ml于小试管中,置37℃水浴预
热2分钟,再加凝血酶溶液0.1ml,记录时间。
相关分析:




首先先清除内存。INV+AC,浓度(log或In)
XD,YD输入(如不取对数,浓度直接输入
XD,YD 读取值DATA输入;全部数据输入完
毕,按INV+9读出相关系数r。
待测读数INV+log或In→读出相关浓度。
^
如不取对数,待测读数直接INV+ŷx→读出
相关浓度。
最终浓度需根据样品稀释倍数乘积。
标准曲线:
t(s)
25
20
15
10
5
0
0.5
1
1.5
2
2.5C(g/L)
如血浆纤维蛋白原含量大于4 g/L
时,应稀释血浆后重测,结果乘以稀释
倍数。低于0.8 g/L时,需将原血浆改
为1∶2或1∶5稀释,在标准曲线上查得
结果后,除以5或除以2。
正常参考值:
2~4mg/ml
临床意义:


纤维蛋白原增高除生理情况下的应
激反应、妊娠后期外,主要出现感
染、灼伤、动脉粥样硬化、急性心
肌梗死、多发性骨髓瘤、糖尿病、
败血症等。
纤维蛋白原减少见于DIC、原发性纤
溶亢进症、重症肝炎、肝硬化和溶
栓治疗时。
评价:
Clauss方法测定的是纤维蛋白原
功能,因此需纤维蛋白原结构正常,
且有一定的含量,对低(无)纤维
蛋白原血症和因此后纤维蛋白原血
症应改用ELISA和RIA等免疫检测手
段。
主要误差来源:



血浆稀释不准。
凝血酶活性不足或失效。凝血酶一
般应在低温保存,稀释后在塑料(聚
乙烯)试管中,置4℃可保存活性24
小时。
测定终点观察不准确,尤其是纤维
蛋白原含量高时,往往很快即凝固,
手工法重复性较差,不易做准。
血浆凝血酶时间TT
原理

以标准凝血酶溶液加入受检血浆,使凝血酶
裂解血浆中的纤维蛋白原,形成纤维蛋白,
造成血浆凝固,此时所需时间为凝血酶时间。
方法:
0.1ml血浆+0.1mlTT试剂,
37℃水浴中观察凝固时间。
正常参考值:
16~18S
评价:

时间大于正常参考值3秒:DIC、肝脏
病变。

TT时间缩短,并不代表高凝状态或
DIC前期,是技术原因。如操作失误,
组织液混入血标本,标本在4℃环境中
放置过久。

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