Lezione3_finale

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Fluorescenza in stato
stazionario
Condizioni fotostazionarie
M+hn
kA
kr
M*
knr
M+hn’
M
  k
d M
*
dt
k A M
 
st
M 
*

 0


M

(
k

k
)
M
A
r
nr
 ( k r  k nr ) M
*
st
M st

kA
( k r  k nr )
 
I st  k r M
*
st
*
st
 k A
 k r k A M
st
 cost.
I st  k r  
•Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui è eccitata una frazione costante di
fluorofori.
•L’intensità di fluorescenza è costante e proporzionale alla resa quantica.
•Con le normali intensità delle lampade, questa frazione è sempre prossima a 0 (kA dipende dal
flusso di fotoni)
Il fluorimetro
Beam splitter
Lampada
lecc.
Monocromatore
di eccitazione
Lente
Campione
lem.
Lente
Monocromatore
di emissione
Computer
PMT
“riferimento”
PMT
“segnale”
I
Strumentazione
Fluorescenza in stato
stazionario
Sorgente
Lampada ad arco
ad alta pressione di xeno
• L’elevata tensione applicata agli
elettrodi provoca una corrente.
• Il flusso di elettroni, urtando gli
atomi del gas, li ionizza o li
eccita.
• Il decadimento o la
ricombinazione ione-elettrone
generano l’emissione di luce.
•
•
•
L a m p a d a X e (o zo n e -fre e )
Ad alta pressione (20-300 Atm). Può esplodere (non
implodere).
Gli impulsi ad alta tensione (40000 V) necessari per accenderla
possono danneggiare l’elettronica. Va accesa per prima.
La lampada è in quarzo, per permettere il passaggio degli UV.
Questa radiazione però ionizza le molecole di ossigeno
dell’aria, che a loro volta generano ozono (che va rimosso per
non danneggiare l’ottica). Se la radiazione nel lontano UV non è
necessaria, si aggiunge all’involucro uno strato in grado di
bloccare questa radiazione (lampade ozone-free, molto comuni
nei fluorimetri).
Il picco a 467 nm viene comunemente utilizzato per calibrare il
monocromatore di eccitazione.
0 .1
In te n s ità (u .a.)
•
0 .0 1
0 .0 0 1
0 .0 0 0 1
200
467nm
300
400
500
l(n m )
600
700
800
Rivelatore
Rivelatore della fluorescenza
effetto fotoelettrico
Rivelatore della fluorescenza
tubo fotomoltiplicatore (PMT)
•Effetto fotoelettrico
•Emissione secondaria
•I fotocatodi sono realizzati utilizzando metalli alcalini o semiconduttori.
•L’efficienza fotoelettrica non è costante con l.
Il PMT può rivelare un singolo fotone (106 e- per fotone)
Rivelazione analogica
Rivelazione digitale
Rivelazione analogica
Rivelazione digitale
Rivelazione digitale: maggiore sensibilità, intervallo dinamico più ristretto.
Rivelazione digitale
Sovrapposizione di impulsi
Durata impulsi 10-9-10-8 s
Limite superiore 105-106 cps
S
N

n
n

n
Per n=10000, S/N=100
Limite inferiore 103-104 conteggi
Si può aumentare la sensibilità semplicemente aumentando
il tempo di integrazione
Distribuzione di Poisson
• Consideriamo un fotomoltiplicatore esposto ad una sorgente di
intensità costante.
• L’emissione (e la rivelazione) sono processi casuali.
• Qual’è la distribuzione di probabilità dei fotoni rivelati in t secondi?
• Definiamo Pn(t) come la probabilità che in un tempo t vengano
rivelati n fotoni. È questa la distribuzione che cerchiamo.
• Definiamo k in base alla seguente equazione (sviluppo in serie):
P1(dt)=kdt+o(kdt)kdt
• Avremo P0(dt)=1-kdt
• Calcoliamo ora la probabilità di non rivelare fotoni in un intervallo in
un intervallo finito t.
Distribuzione di Poisson
Per rivelare 0 fotoni in un tempo t, deve averne rivelati 0 nel tempo t-dt e 0 nel tempo dt
P0 ( t )  P0 ( t  dt ) P0 ( dt )  P0 ( t  dt ) 1  kdt   P0 ( t  dt )  P0 ( t  dt ) kdt
P0 ( t )  P0 ( t  dt )   P0 ( t  dt ) kdt
P0 ( t )  P0 ( t  dt )
dt
lim
  kP0 ( t  dt )
P0 ( t )  P0 ( t  dt )
dt  0
dP0 ( t )
dt
dP0 ( t )
dt
 lim  kP0 ( t  dt ) 
dt  0
  kP0 ( t )
  kdt
P0 ( t )
Ln  P0 ( t )   Ln  P0 ( 0 )    kt
Ln  P0 ( t )   Ln 1   kt
Ln  P0 ( t )    kt
P0 ( t )  e
 kt
Distribuzione di Poisson
Troviamo ora un’equazione analoga per Pn(t)
Pn ( t )  Pn ( t  dt ) P0 ( dt )  Pn  1 ( t  dt ) P1 ( dt )
 Pn ( t  dt )(1  kdt )  Pn  1 ( t  dt ) kdt
 Pn ( t  dt )  Pn ( t  dt ) kdt  Pn  1 ( t  dt ) kdt
Pn ( t )  Pn ( t  dt )   Pn ( t  dt ) kdt  Pn  1 ( t  dt ) kdt
Pn ( t )  Pn ( t  dt )
dt
lim
Pn ( t )  Pn ( t  dt )
dt  0
dP n ( t )
dt
dP n ( t )
dt
  k  Pn ( t  dt )  Pn  1 ( t  dt ) 
dt
 lim  k  Pn ( t  dt )  Pn  1 ( t  dt ) 
dt  0
  k  Pn ( t )  Pn  1 ( t ) 
 kPn ( t )  kPn  1 ( t )
Quest’equazione differenziale lega Pn a Pn-1. Grazie ad essa ed al
fatto che conosciamo P0, possiamo trovare la funzione di
distribuzione.
Distribuzione di Poisson
Integriamo l’equazione differenziale, moltiplicando per ekt
dP n ( t )
dt
e
kt
P2 ( t ) 
P1 ( t ) 
 kPn ( t )  kPn  1 ( t )
t
t
dP n ( t )
dt
 ke Pn ( t )  ke Pn  1 ( t )
kt
kt
 ke
 kt
 e P0 ( t ' ) dt ' 
kt '
dt
 ke Pn  1 ( t )
kt
 ke
 kt
e Pn ( t )  Pn ( 0 ) 
kt
 ke
kt '
Pn  1 ( t ' ) dt '
t
t
 kt
0
e Pn ( t ) 
dt ' 
 ke
 kt
 dt ' 
 e kt ' e
kt '
 ke
kt '
Pn  1 ( t ' ) dt '
 kte
 kt
 k e
 t ' dt ' 
0
 k
2
t
2
e
 kt

2
 e Pn  1 ( t ' ) dt '
kt '
0
Pn ( t ) 
( kt )
n!
n
e
( kt )
2
t
Pn ( t )  ke
dt ' 
t
 kt
2
0
 kt
 kt '
0
0
t
kt
kt '  kt '
e e
t
 ke
kt '
0
0
t
 e P1 ( t ' ) dt ' 
0
kt
de Pn ( t )
 ke
 kt
 kt
2
e
 kt
Distribuzione di Poisson
Calcoliamo la media
n
n (t ) 
n
 nPn ( t )   n
n0
n 1
( kt )
n
e
 kt
e
 kt
n
n 1
( kt )
 ( n  1)! kte
kt
n!
 kt
n 1
j

( kt )
j0
j
 kte
( j )!
k rappresenta il rate (medio) di rivelazione di fotoni!
Calcoliamo la deviazione standard
n  n
2
n
2
 n
2
2
 n  n  n  n  n  n  n ( n  1)  n
2
2
 n  n ( n  1)  n  n
2
2
n
n ( n  1) 

n
n ( n  1) Pn ( t ) 
n0
e
 kt
n
( kt )
2
 n ( n  1)  kt  ( kt )
( kt )

n ( n  1)
 ( n  2 )!  ( kt )
2
n2
e
 kt
j

n
 kt
e

n!
n2
n2
( kt )
2
( kt )
j0
j
 ( kt ) e
2
 kt
e
kt
 ( kt )
( j )!
 n  n ( n  1)  kt  ( kt )  ( kt )  kt  ( kt )  kt  n
2
2
2
2
Media e deviazione standard sono uguali!
2
 kt
e
kt
 kt
Se n è il numero medio di
conteggi al secondo:
S
N

n

n
n
Il rapporto segnale-rumore
aumenta con la radice di n

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