wyklad 4_online

Report
Podsumowanie – wykład 4
•
Metoda amplifikacji 3’i 5’ końców cDNA (RACE PCR)
•
Wektory plazmidowe do klonowania – test selekscyjny białych i niebieskich kolonii
bakteryjnych
•
Metody analizy ekspresji pojedynczych genów i całych transkryptomów

Northern- blot

Technika ochrony przed aktywnością RN-azy (RPA)

Półilościowy RT-PCR (warunki reakcji, zasada amplifikacji)

Real Time PCR (warunki i zasada amplifikacji)

Analiza mikromacierzy DNA

Sposoby wyciszania genów (nokautowanie, iRNA, siRNA)
– przykład wyciszania genu kodującego syntazę chalkonową CHS u roślin z rodziny goryczkowatych i petuni.
RACE –Rapid Amplification of cDNA Ends
Gene Racer TM RACE Ready cDNA Kit Manual (Invitrogen)
• Technika szybkiej amplifikacji 3’ i 5’ końców cDNA (RLM-RACE)
• Charakterystyka regionów promotorowych
• Otrzymywanie kompletnej sekwencji cDNA
31751359=1816
214
5’
1
3175 pz.
3’
1602
Schemat dobudowywania końców 3’ i 5’ do znanego
fragmentu genu
214
GSP for
GenePacer 5’PRIMER
Gene Racer Oligo RNA
ATG
gen pompy protonowej 1359pz.
GeneRacerOligo dT-3’
GeneRacer 3’PRIMER
GSP rev
1602
Dołączenie oligo(dT) przy użyciu terminalnej transferazy do końca 3’
Reakcja PCR z użyciem GSP (gene specific primer) i primera komplementarnego do linkera oligo dT (Gene
Race 3’ Primer)
Przyłączenie „adaptera” oligo RNA na 5’
Wzmocnienie swoistości amplifikacji przez PCR ze starterami swoistymi do kolejnych bardziej
wewnętrznych regionów DNA („nested” PCR)
Zakotwiczony PCR – nested PCR
„Zakotwiczony” PCR podnosi specyficzność i intensywność produktów
RACE dla 5’ i 3’ końców badanego genu
Stosowany wówczas gdy otrzymujemy wiele transkryptów różnej wielkości
lub „smary” po reakcji PCR
•matrycą jest cDNA otrzymany po pierwszej reakcji PCR
•startery typu „nested” dla 3’ i 5’
-specyficzne
-Gene Racer
Białe i niebieskie kolonie bakteryjne
• Wykrywanie zrekombinowanych plazmidów
• Gen LacZ kodujący b-galaktozydazę pod kontrolą promotora lac
• W szczepie bakterii E. coli z represorem lac ekspresję genu lac indukuje się
podając IPTG- izopropylo-beta –D- tiogalaktopiranozyd
• Aktywna beta-galaktozydaza rozkłada substrat X-Gal (5-bromo-4chloro-3
indolilo-β-D-tiogalaktopiranozyd) prowadząc do powstania niebieskiego
produktu
• Insercja w genie lacZ prowadzi do inaktywacji enzymu stąd biała barwa
kolonii.
PCR w czasie rzeczywistym (real time pcr)
• Termocykler sprzężony z fluorymetrem, który umożliwia pomiar fluorescencji w
trakcie trwania reakcji PCR
• PCR z jednoczesną analizą przyrostu ilości produktu na podstawie fluorescencji
- wykrywanie produktu we wczesnych fazach reakcji
-monitorowanie kinetyki reakcji PCR w trakcie jej trwania
• Ilość produktu po zakończonej reakcji powinna być proporcjonalna (wykładniczo)
do początkowej puli cDNA
• Wzrost fluorescencji jest proporcjonalny do liczy namnożonych cząsteczek DNA
Porównanie ekspresji metodą mikromacierzy
•
•
•
•
Izolacja RNA-- odwrotna transkrypcja--cDNA (wyznakowany
barwnikiem fluorescencyjnym)
-barwnik czerwony (Cy5)
-barwnik zielony (Cy3)
Wymieszanie obu próbek cDNA
Hybrydyzacja z sondami w każdej plamce mikromacierzy
Wzbudzenie przez światło lasera – „plamka” będzie
fluoryzować na czerwono jeśli -związała więcej czerwonego
barwnika = nadekspresja genu w chorej tkance; odwrotnie
plamka będzie fluoryzować na zielono jeśli ekspresja ulega
obniżeniu w chorej tkance w porównaniu z tkanką
prawidłową.
http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM&feature=related
Nokautowanie RNA – iRNA, siRNA
Wprowadzenie różnego typu dwuniciowych RNA (iRNA, siRNA) do komórki prowadzi
do degradacji transkryptów mRNA – wydajna metoda do wyłączania (nokautowania
genu) w celu eliminacji jego funkcji;
Wprowadzenie dodatkowych kopii genu
kodującego syntazę chalkonową
nadającą płatkom petunii fioletową
barwę zamiast nasycać barwą
spowodowało,że stały się one
miejscami białe.
Wyciszenie genu syntazy
chalkonowej przy użyciu iRNA
u gatunków Gentiana triflora
(goryczkowate) powoduje białe
zabarwienie płatków

similar documents