ميکروبشناسی ادرار

Report
‫بسم هللا الرحمن الرحیم‬
‫کارگاه میکروب شناسی‬
‫سیستم ادراری‬
‫کشت ادراربه منظور تشخیص عفونت مجاري ادراري دربیماران مبتال‬
‫به ديزوري‪ ،‬تكرار يا اضطرار در دفع ادرار‪ ،‬همچنین در موارد تب با‬
‫منشا ناشناخته و يا احتمال عفونت در تجزيه ادرار ضرورت مي يابد‬
‫عوامل تداخل كننده در کشت ادرار‪:‬‬
‫آلودگي ادرار با مدفوع‪ ،‬ترشحات واژن‪ ،‬دست ها يا لباس ها‪ ،‬استفاده از‬
‫آنتي بیوتیك ها‬
‫جمع آوری نمونه ادرار برای انجام‬
‫کشت میکروبی‬
‫روش نمونه گيري‪:‬‬
‫متداولترين نمونه ‪،‬ادرار وسط تمیز گرفته شده می باشد‪.‬جهت احتراز از آلودگی نحوه‬
‫جمع آوری حائز اهمییت می باشد‪.‬‬
‫در مورد زنان بايد آموزش الزم در خصوص تمیز کردن نواحی اطراف منفذ پیشابراه‬
‫با استفاده از يک قطعه گاز تمیز آغشته با سرم فیزيولوزی استريل داده شود از هیچ‬
‫گونه محلول ضدعفونی کننده ای نبايد استفاده شود زيرا اين محلولها می توانند به نمونه‬
‫ادرار راه يافته و سبب ايجاد کشت منفی گردند ‪.‬‬
‫( ابتدا منفذ ادرار بايد به طور دقیق با محلول يددار جهت كاهش آلودگي نمونه شستشو‬
‫داده شود‪ .‬ظرف ادرار استريل را به نحو صحیح در محل مناسب قرار داده‪ ،‬مقداري‬
‫ادرار را دور ريخته و ‪ 5 -10‬سي سي ادرار از ادرار وسط را تهیه نمايند‪ ،‬درپوش‬
‫ظرف را ببندند‪).‬‬
‫نبايد اجازه داد نمونه ادرار در بخش يا توالت به مدت طوالنی باقی بماند ‪.‬اين موضوع‬
‫باعث تکثیر ارگانیسم های موجود در ادرار گردد زيرا ادرار يک محط مناسب برای‬
‫رشد آنهاست‪.‬‬
‫هیچ نمونه ای غیر از نمونه آسپیره شده ناحیح فوق عانه از مثانه برای بررسی عفونت‬
‫ادراری با عوامل بی هوازی مناسب نخواهد بود‪.‬‬
‫‪-‬‬
‫ در صورتي كه نمونه در منزل تهیه مي شود حداكثر طي ‪ 20‬دقیقه پس از جمع آوري ادرار‬‫بايد آنرا در يخچال قرار داده‪ ،‬نمونه ادرار را مي توان تا‪ 12- 24‬ساعت پس از جمع آوري در‬
‫يخچال نگه داري كرد‪ .‬در زمان انتقال نمونه به آزمايشگاه آن را در كنار يخ قرار دهند‪.‬‬
‫ در مورد بیماراني كه قادر به دفع ادرار نمي باشند مي توان از سند ادراري استفاده كرد‪.‬‬‫نمونه هاي اطفال و كودكان كم سن را در كیسه هاي يكبار مصرف به نام كیسه‪ U‬چمع آوري‬‫مي كنند‪.‬اين كیسه ها داراي چسبي در اطراف پشت منفذ مي باشد كه به پوست پوبیك كودك‬
‫مي چسبد‪ .‬منفذ پیشابراه را پیش از چسباندن كیسه ها بايد تمیز نمايند‪ .‬حتي المقدور صبح اول‬
‫وقت كیسه را به شیرخوار وصل كرده و تا ظهر ادرار جمع شده ارسال گردد‪.‬‬
‫معیار های نپذیرفتن نمونه ها ی ادرار‬
‫‪-1‬نمونه آسپیره شده برای بیهوازی نبايد به داخل لوله ويا ظرف تخلیه شود‬
‫زيرا تمام عوامل بی هوازی در مواجهه با اکسژن هوا کشته می شوند‬
‫‪ -2‬نمونه هايی که در ظرف اشتباه فرستاده شده ويا برچسب اشتباه دارند‬
‫‪-3‬نمونه هايی که در ظروف نشت دار ويا ظروف مقوايی گرفته می شوند‪.‬‬
‫· نمونه ادرار ‪ 24‬ساعته‪:‬‬
‫طیف گسترده اي از بیماري ها بويژه بیماري هاي آندوكرين توسط نمونه‬
‫ادرار ‪ 24‬ساعته قابل تشخیص اند‪.‬‬
‫روش جمع آوري نمونه‪:‬‬
‫اولین ادرار را انجام داده و آنرا دور بريزند و زمان دقیق را يادداشت كنند‬
‫(مثال ساعت ‪ 7‬صبح)‪ ،‬به مدت يك شبانه روز (‪ 24‬ساعت)‪ ،‬يعني تا ساعت ‪7‬‬
‫صبح فردا تمامي نوبت هاي دفع ادرار بايد در ظرف مخصوص جمع آوري‬
‫شده‪ ،‬در جاي خنك ترجیحا يخچال نگه داري و پس از اتمام كار به آزمايشگاه‬
‫ارسال كنند‬
‫نحوه انجام کشت ادرار‬
‫نمونه ادرار نبايد سانتريفوژ شود و قبل از برداشت با لوپ بايد کامالٌ‬
‫يکنواخت گردد از لوپ کالیبره شده استفاده شود ‪ ،‬لوپ را بصورت عمودی‬
‫در ظرف ادرار فرو برده وبصورت يک خط در وسط محیط کشت نهاده و‬
‫سپس همانند شکل آن را پخش می نمايیم ‪ .‬معموالٌ از لوپ ‪ 0.001‬استفاده می‬
‫شود به جز در سندرم حاد يوترال خانم ها و نمونه سوپر ايوبیک که لوپ‬
‫‪0.01‬‬
‫بکار می رود‪.‬‬
‫توجه ‪:‬برای هر يک از محیط ها يکبار لوپ را داخل ادرار نموده وپس از‬
‫انجام کشت روی شعله استريل نموده وبرای محیط ديگر مجدداٌ عمل کشت را‬
‫از ابتدا انجام دهید‪.‬‬
‫عوامل بیماریزای احتمالی در ادرار‬
‫الف‪-‬باکتری های گرم منفی ‪:‬‬
‫اشريشیاکولی‪،‬کلبسیال‪،‬آنتروباکترها‪،‬پروتئوس‪،‬سودوموناسها‪،‬‬
‫سالمونالپاراتايفی و نايسريا گونوره‪.‬‬
‫ب‪ -‬باکتريهای گرم مثبت‪:‬‬
‫انتروکوکوس‪،‬استاف اپیدرمیديس‪،‬استاف ساپروفیتیکوس‪،‬‬
‫استاف ارئوس و استرپتوکوکهای همولیتیک‬
‫تعیین تعداد باکتری‬
‫تعداد کلونی ايجاد شده در محیط بالد آگار را بعد از‬
‫‪ 24‬ساعت شمارش نموده در ضريب حجم لوپ ضرب‬
‫می نمايیم‬
‫تهیه گسترش ورنگ آمیزی باکتری‬
‫اولین اقدام جهت شناسايی باکتری تهیه ی گسترش و رنگ آمیزی می باشد‪.‬‬
‫بدين منظور ابتدا يک قطره سرم فیزيولوژی استريل بر روی الم (مرکز الم )‬
‫قرار داده سپس با يک آنس استريل يک قسمت کوچک از کلونی مورد نظر را‬
‫برداشته در قطره سرم فیزيولوژی حل نموده بصورت شیرابه در سطح الم به‬
‫اندازه وضخامت مناسب پخش می نمايیم‪.‬‬
‫پس از خشک شدن با کمک حرارت ماليم شعله فیکس نموده والم آماده برای‬
‫رنگ آمیزی می باشد‪.‬‬
‫ساخت رنگ متیلن بلو‬
‫‪3‬دهم گرم متيلن بلو رادر‪ 30‬ميلی ليتر اتيل الکل ‪95‬درصد‬
‫بطور کامل حل نمایيد پس از‪24‬ساعت این محلول راازکاغذ‬
‫صافی عبور دهيدتاصاف شود‬
‫رنگ آمیزی متیلن بلو‪:‬‬
‫‪ -1‬سطح گسترش رابه مدت ‪3‬تا‪ 4‬دقیقه بارنگ بپوشانید‬
‫سپس الم راباآب بپوشانید و شستشودهید‪.‬‬
‫‪ -2‬پس ازخشک شدن الم (در هواياباکاغذ خشک کن) آنرا‬
‫بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار می دهیم ‪ .‬دراين رنگ‬
‫آمیزی باکتری به رنگ آبی مشاهده می شود ‪.‬‬
‫ساخت رنگ گرم‬
‫روش ساخت کریستال ویوله‬
‫‪ 20‬گرم کریستال ویوله رادر‪ 100‬ميلی ليتر اتانول ‪ 95‬درصد حل کرده بنام محلول ‪A‬‬
‫یک گرم اگزالت آمونيوم رادر‪ 100‬ميلی ليتر آب مقطرحل کرده بنام محلول ‪B‬‬
‫محلول ‪ A‬رابه نسبت ‪ 1‬به ‪ 10‬رقيق کرده وبا ‪ 4‬برابر محلول ‪ B‬مخلوط کرده صاف می نمایم‬
‫روش ساخت لوگول‬
‫یک گرم یدکریستال ودوگرم یدورپتاسيم راسایيده ومخلوط می کنيم وسپس ‪ 300‬ميلی ليتر آب‬
‫مقطر رابه آرامی به آن اضافه می کنيم‬
‫روش ساخت محلول بی رنگ کننده‬
‫‪ 250‬ميلی ليتر اتانول ‪ 95‬درصد رابا‪ 250‬ميلی ليتر استون ترکيب کرده ودر شيشه های درب‬
‫دار نگهداری می کنند ‪.‬‬
‫سافرانين (رنگ مخالف)‬
‫‪ 2/5‬گرم سافرانين رابا‪ 100‬ميلی ليتر اتانول ‪ 95‬درصد مخلوط کرده ودرشيشه های درب دار‬
‫نگهداری می کنند ‪.‬‬
‫‪THE GRAM STAIN‬رنگ آمیزی گرم ‪:‬‬
‫اين روش رنگ آمیزی يکی از مهمترين ومتداولترين روشهای‬
‫رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کريسین‬
‫گرم ابداع شد ‪ .‬دراين رنگ آمیزی باکتريها بر مبنای رنگ‬
‫باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم‬
‫می شوند ‪ .‬رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانايی حفظ‬
‫رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان ديواره سلولی باکتری بستگی‬
‫دارد ‪ .‬دررنگ آمیزی گرم باکتريهای گرم مثبت پس ازرنگ‬
‫آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به رنگ قرمز‬
‫مشاهده می شود‬
‫روش رنگ آمیزی گرم‬
‫‪ -1‬رنگ کريستال ويوله رابه مدت ‪30‬تا‪ 45‬ثانیه برروی گسترش ريخته درنتیجه همه باکتری ها به رنگ‬
‫بنفش درخواهد درآمد‬
‫‪ -2‬پس از شستشو گسترش با آب به مدت ‪30‬تا‪ 45‬ثانیه با لوگل می پوشانند لوگل باکريستال ويوله ترکیب‬
‫شده وايجاد کمپلکس های بزرگی می نمايید که باعث تثبیت رنگ کريستال ويوله درداخل ديواره سلولی‬
‫باکتری می شود ‪ .‬پس ازاين مرحله نیزکماکان همه باکتريها به رنگ بنفش مشاهده می شوند ‪.‬‬
‫مرحله رنگ زدايی مهمترين مرحله رنگ آمیزی است دراين مرحله پس از شستشو الم با آب الم به مدت‬
‫‪ 15‬تا‪ 20‬ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار‬
‫می گیرد ‪ .‬درباکتريهای گرم منفی که دارای اليه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی‬
‫هستند اين حالل باعث حذف اين اليه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد ‪.‬‬
‫ولی درباکتريهای گرم مثبت به علت تعداد زياد اليه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا‬
‫رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود ‪.‬درنتیجه پس ازاين مرحله باکتريهای گرم منفی بی رنگ ولی‬
‫باکتريهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند ‪.‬‬
‫‪ -4‬در انتها سطح گسترش راباسافرانین يا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ‪ 30‬تا‪ 45‬ثانیه می پوشانیم سپس‬
‫باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد ‪ .‬دراين مرحله‬
‫باکتريهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آيند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند ‪.‬‬
‫گرم مثبت‬
‫گرم منفی‬
‫اشکال مختلف باکتری‬
‫سه شکل معمول از باکتری ها وجود دارد‪:‬‬
‫‪ -1‬کوکسی‪ :‬شكل يك باكتري كوكسي شكل معموالدايره شكل‬
‫است بعضي اوقات تخم مرغي يا درا ز و تقريبا نیم میكرومتر‬
‫قطر دارند‬
‫‪-2‬باسیل‪ :‬به شکل میله ای‬
‫‪-3‬اسپريلیوم‪ :‬به شکل فنری‬
‫اسكن الكتروميكروكراف‬
‫استربتوكوكوس بنومونيا‬
‫انواع کوکسی‬
‫تتراد ‪ 4‬كوكسي‬
‫استربتوكوكوس‬
‫اسكن الكتروميكروطراف استافيلوكك‬
‫اريوس‬
‫تقسيم به صورت تصادفي توليد‬
‫استافيلوكوك (خوشه انكوري) مي كند‬
‫اسكن الكتروميكروگراف يك‬
‫باسيلوس‬
‫باسيل‬
‫اسپيریل‪ :‬به يك تا سه فرم ديده ميشود‬
‫استربتو باسيلوس ‪ :‬باسيل رشته اي‬
‫ويبريو ‪ :‬يك اسبريل ناكامل يا كاما شكل‬
‫اسكن الكترون ميكروكراف ويبريو كلرا‬
‫اسبيروكيت‪ :‬اسبريل نازك وبيجيده‬
‫اسبريل سفت ونازك‬
‫اسكن الكتروميكروگراف اسبيروكيت‬
‫فتوميكروگراف اسبيروكيت‬
‫محیط های کشت مورد نیاز برای کشت‬
‫ادرار‬
‫بالد آگار ‪:Blood agar‬‬
‫اين محیط بطور گسترده ای در باکتری شناسی پزشکی استفاده می شود ‪،‬‬
‫عالوه بر اينکه يک محیط غنی شده است‪ ،‬يک محیط شاخص برای نشان دادن‬
‫خواص همولیتیک باکتری هايی مثل استرپتوکوک پنومونیه و پیوژنز می‬
‫باشد‪.‬و عموما ٌ در پلیت مورد استفاده قرارمی گیرد‪.‬‬
‫اين محیط ‪ ،‬با افزودن خون استريل (ترجیحا ٌ خون گوسفندی) به نوترينت‬
‫آگار استريل مذاب که تا ‪ 50‬درجه خنک شده باشد تهیه می گردد‪.‬‬
‫غلظت خون ممکن است برای اهداف خاصی از ‪ %5-50‬تغییر کند ولی‬
‫معمول ترين غلظت برای کارهای روتین ‪ %10‬می باشد‪.‬‬
‫کنترل کیفی بالد آگار‬
‫ميکروارگانيسم‬
‫هموليز‬
‫رشد‬
Strep.pyogenes ATCC 19615
‫بتا‬
+
Strep.pneumoniae ATCC 6305
‫آلفا‬
+
Staph.aureus ATCC 25923
+
Esch.coli ATCC 25922
+
‫)‪:Chocolate agar(Heated blood agar‬‬
‫اين محیط برای هموفیلوس انفلوانزا و ديگر ارگانیسم های سخت رشد مثل‬
‫نیسريا و پنوموکوک مناسب است ‪.‬در هنگام تهیه اين محیط در طی حرارت‬
‫دادن گلبول های قرمز پاره می شوند و مواد مغذی رها می گردند ‪.‬‬
‫نوترينت آگار را ذوب نموده در حرارت ‪ 75‬درجه به آن خون استريل ‪%10‬‬
‫اضافه نموده ‪ ،‬خون و آگار را با تکان دادن ماليم مخلوط کنید تا وقتی که‬
‫رنگ خون قهوه ای شکالتی شود سپس در لوله به صورت شیب دار يا در‬
‫پلیت تقسیم نمايید‪.‬‬
‫مولر هینتون آگار ‪Mueller Hinton agar‬‬
‫اين محیط در اصل برای جدا سازی گونه نیسريای بیماريزا تهیه شده ‪.‬‬
‫امروزه برای ديسک های آنتی بیوتیکی به منظور آنتی بیوگرام با‬
‫تکنیک کربی – باير به کار می رود‪.‬‬
‫ائوزين متیلن بلوآگار‪:EMB-‬‬
‫اين محیط کشت ‪ ،‬محیط افتراقی – انتخابی مفیدی در جداسازی وشناسايی‬
‫باکتری های روده ای گرم منفی است ‪.‬‬
‫رنگ های ائوزين و متیلن بلو اجزائ انتخابی هستند ‪ ،‬در حالی که به باکتری‬
‫های گرم منفی اجازه رشد می دهند‪ ،‬از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری‬
‫می کنند ‪ .‬قند های الکتوز وساکاروز به محیط اضافه شده تا ايزوله را بر‬
‫اساس تخمیر الکتوز تفکیک کنند ‪ .‬تخمیر با تغییر رنگ و رسوب رنگ های‬
‫افزوده شده در اثر افت ‪.‬پی اچ مشخص و ارزيابی می شود ‪ .‬عمدتا ٌ پاتوژن‬
‫ها الکتوز مثبت می باشند‪.‬که کلونی های آبی – سیاه با درخشندگی فلزی‬
‫متمايل به سبز ايجاد می کنند (اشريشیا کلی)‪ .‬ديگر کلی فرم های الکتوز مثبت‬
‫مثل انتروباکتر کلونی صورتی رنگ ايجاد می کنند‪.‬‬
‫کلونی های الکنوز منفی (غیر تخمیری) شفاف بوده و کهربايی رنگ يا بی‬
‫رنگ می باشند‪.‬‬
‫کنترل کیفی ‪EMB‬‬
‫ميکروارگانيسم‬
‫رنگ کلونی‬
‫رشد‬
‫آبی –سیاه بادرخشندگی سبز‬
‫فلزی‬
‫‪+‬‬
‫‪E.Coli ATCC25922‬‬
‫بیرنگ تا کهربايی‬
‫‪+‬‬
‫‪Sal.typhimurium‬‬
‫‪ATCC14028‬‬
‫محیط مک کانکی ‪:MacConkey Agar-‬‬
‫اين محیط برای جداسازی باکتری های الکتوز مثبت از الکتوز منفی می باشد‪ ،‬دارای نمک های‬
‫صفراوی و مقدار کمی کريستال ويوله جهت جلوگیری از رشد گرم مثبت ها است به همین جهت‬
‫به آن محیطی انتخابی و افتراقی نیزمی گويند‪.‬‬
‫بر خالف محیط ‪ EMB‬ساکاروز ندارد معرف محیط نوترال رد می باشد الکتوز مثبت ها قرمز يا‬
‫صورتی والکتوز منفی ها بیرنگ می باشند ‪.‬‬
‫‪ M.C‬محیط افتراقی – انتخابی ضعیف ومناسب برای کشت مدفوع می باشد‪.‬‬
‫‪ EMB‬محیط افتراقی – انتخابی ضعیف ومناسب برای کشت ادرار می باشد‪.‬‬
‫کنترل کیفی مک کانکی آگار‬
‫ميکروارگانيسم‬
‫رنگ کلنی‬
‫رشد‬
‫قرمز گل سرخی‬
‫‪+‬‬
‫‪E.Coli ATCC 25922‬‬
‫بیرنگ‬
‫‪+‬‬
‫‪Pro.mirabilis ATCC 12453‬‬
‫بیرنگ‬
‫‪+‬‬
‫‪Sal.typhimurium ATCC 14028‬‬
‫محیط های افتراقی جهت شناسایی‬
‫باسیل های گرم منفی‬
‫)‬
‫‪Triple Sugar Iron Agar(TSI Agar‬‬
‫اين محیط حاوی سه قند گلوکز‪،‬الکتوز و ساکاروز می باشد معرف محیط فنل رد بوده وعالوه بر‬
‫آن حاوی سولفات فروز بوده که برای بررسی تولید سولفید هیدروژن استفاده می گردد‪ .‬برای‬
‫تفکیک باسیل های روده ای گرم منفی بر اساس تخمیر کربوهیدرات (تغییر رنگ در حضور‬
‫معرف از قرمز به زرد) وتولید سولفید هیدروژن(سیاه شدن درعمق لوله) به کار میرود‪ .‬غلظت‬
‫گلوکز يک دهم (‪ )0.1‬غلظت الکتوز يا ساکاروز است‪.‬‬
‫اگر محیط در عمق لوله زرد شود(اسیدی)‪ ،‬اما در سطح شیب دار قرمز شود(قلیايی) ‪ ،‬ارگانیسم‬
‫گلوکز مثبت می باشد‪ .‬رنگ زرد در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم مورد‬
‫نظر گلوکز‪ ،‬الکتوز و ساکاروز مثبت می باشد‪ .‬رنگ قرمز در سطح شیب دار و عمق نشان‬
‫می دهد که ارگانیسم تحت بررسی يک غیر تخمیر کننده است‪.‬‬
‫بعضی از میکرو ارگانیسم ها ممکن است در روی محیط کلیگلر آيرون آگار سولفید هیدروژن‬
‫تولید کنند ولی در محیط سه قندی به دلیل وجود ساکاروز که در بعضی موارد مکانیسم آنزيمی‬
‫تولید سولفید هیدروژن را مهار می کند ايجاد اين گاز را نمی کنند مثل بعضی از سالمونال ها و‬
‫انتروباکترياسه‪.‬‬
TSI ‫کنترل کیفی محیط‬
‫ميکروارگانيسم‬
‫سطح شيب دار‬
‫عمق‬
‫گاز‬
SH2
E.Coli
ATCC25922
A
A
+
-
Pse.aeruginosa
ATCC27853
K
K
-
-
Sal.typhimurium
ATCC14028
K
A
+
+
Shi.flexneri
ATCC 12022
K
A
-
-
‫محیط اوره –‪Urea agar‬‬
‫اين محیط برای جدا سازی با کتری هايی که قادربه استفاده از اوره و تولید‬
‫آنزيم اوره آز می باشند به کار می رود مانند پروتئوس و به دو صورت‬
‫‪ Urease Test Broth‬و ‪ Urea agar Base‬تهیه می شوند‪.‬‬
‫کنترل کیفی محیط اوره‬
‫ميکرو ارگانيسم‬
‫تغيير رنگ‬
‫واکنش اوره آز‬
‫قرمز‪ -‬صورتی تند‬
‫تا قرمز‪ -‬ارغوانی‬
‫‪+‬‬
‫‪Pro.vulgaris ATCC 8427‬‬
‫بدون تغییر رنگ‬
‫‪-‬‬
‫‪Sal.typhimurium ATCC‬‬
‫‪13311‬‬
‫محیط ‪MR-VP Broth‬‬
‫اين محیط برای تفکیک باکتری ها براساس واکنش های متیل رد و‬
‫وژسپروسکوئر به کار می رود ‪.‬‬
‫در اين محیط با افزودن معرف آلفا نفتول به کشت های میکروبی که قادر به‬
‫تولید محصول استوئین(استیل متیل کربینول) از تخمیر دکستروز(گلوکز) می‬
‫باشند در حضور اکسیژن و قلیا اکسید می شود تا دی استیل را تولید کند که با‬
‫کراتین واکنش می دهد ورنگ قرمز تولید می کند ‪ .‬اين واکنش را‬
‫وژسپروسکوئر مثبت گويند ‪.‬‬
‫میکروب های متیل رد مثبت ‪ ،‬مقادير زيادی اسید در طی تخمیر گلوکز تولید‬
‫می کنند که بر سیستم بافری فسفات غلبه کرده و به محض افزودن معرف‬
‫متیل رد رنگ قرمز تولید می کند ‪.‬‬
‫ساخت معرف آلفانفتول‬
‫‪-1‬محلول ‪:A‬‬
‫‪5‬گرم آلفانفتول را در مقدار کمی الکل اتیلیک ‪ 95‬درجه حل کرده وحجم آنرا بتدريج به‬
‫‪ 100‬میلی لیتر می رسانیم‬
‫‪.‬‬
‫‪ -2‬محلول ‪:B‬‬
‫‪ 40‬گرم هیدروکسید پتاسیم را در ‪100‬ملی لیتر آب مقطر حل می کنیم و در يخچال نگه می داريم‬
‫برای تست ابتدا ‪ 6‬قطره از معرف ‪ A‬اضافه وسپس ‪ 2‬قطره از معرف ‪ B‬اضافه کرده لوله را تکان داده و ‪ 15‬دقيقه‬
‫بی حرکت قرار می دهیم پیدايش رنگ صورتی متمايل به قرمز نتیجه مثبت است‬
‫‪.‬‬
‫ساخت معرف متیل رد‬
‫‪ 0.1‬گرم متیل رد را در ‪ 300‬میلی لیتر الکل اتیلیک ‪95‬‬
‫درجه حل نموده وسپس ‪ 200‬میلی لیتر آب مقطر به آن‬
‫اضافه می کنیم‪ .‬محلول را در ظرف قهوه ای نگهداری‬
‫می کنیم ‪.‬‬
‫پس از اضافه کردن چند قطره به محیط مورد نظر در‬
‫صورت مثبت بودن قرمز رنگ می شود‪.‬‬
MR-VP ‫کنترل کیفی‬
‫ميکرو ارگانيسم‬
MR
VP
E.Coli ATCC 25922
+
-
Enterobacter aerogenes
ATCC 13048
-
+
‫محیط)‪Sulfide Indol Motility(SIM‬‬
‫اين محیط برای جداسازی باسیل های روده ای بر اساس تولید سولفید‪ ،‬اندول و‬
‫حرکت به کار می رود‪.‬اين مشخصه ها در شناسايی انتروباکترياسه مخصوصا ٌ‬
‫سالمونال وشیگال کمک می کند ‪.‬در اين محیط تیوسولفات سديم و سولفات‬
‫آمونیم فروز معرف های سولفید هیدروژن ‪،‬معرف کواکس يا ارلیخ برای‬
‫اندول که در اثر استفاده از پپتون کازئین که سرشار از تريپتوفان است به‬
‫وجود می آيد استفاده می شود و شناسايی حرکت به علت طبیعت نیمه جامد‬
‫محیط امکان پذير است‪.‬‬
SIM ‫کنترل کیفی‬
‫ميکرو ارگانيسم‬
SH2
‫اندول‬
‫حرکت‬
E.Coli ATCC
25922
-
+
+
Sal.typhimuriu
m ATCC 13311
+
-
+
Shigella flexneri
ATCC 9199
-
-
-
‫ساخت محلول کواکس یا ارلیخ‬
‫‪ 2‬گرم از پودر پارا دی متیل آمینوبنزآلدئید ‪190 +‬میلی لیتر‬
‫اتیل الکل ‪40 +‬میلی لیتر اسید کلريدريک غلیظ‬
‫برای آزمايش حدود ‪ 2‬میلی لیتر از محیط مورد نظر را‬
‫داخل لوله ای ريخته وچند قطره از معرف کواکس به آن‬
‫اضافه می کنیم در صورت مثبت بودن حلقه قرمز رنگ بین‬
‫محیط ومعرف الکلی ايجاد می گردد‪.‬‬
‫چنانچه نتیجه منفی بود محیط را ‪ 24‬ساعت ديگر برای‬
‫بررسی نگه می دارند ‪.‬‬
‫سیمون سیترات ‪Simmons Citrate Agar‬‬
‫برای افتراق باکتری های گرم منفی بر اساس مصرف سیترات به کار‬
‫می رود ‪.‬‬
‫ارگانیسم هايی که قادرند آمونیم دی هیدروژن فسفات و سیترات سديم‬
‫را به عنوان تنها منابع نیتروژن وکربن مصرف کنند به طور نسبی بر‬
‫روی اين محیط رشد می منند و واکنش قلیايی تولید می کنند که با‬
‫تغییر رنگ معرف برم تیمول بلو از سبز(خنثی) به آبی(قلیايی)‬
‫مشخص می شود‪.‬‬
‫کنترل کیفی سیمون سیترات‬
‫ميکرو ارگانيسم‬
‫تغيير رنگ‬
‫رشد‬
‫آبی در سطح شیب دار‬
‫‪+‬‬
‫‪Enterobacter‬‬
‫‪aerogenes ATCC‬‬
‫‪13048‬‬
‫عدم تغییر رنگ‬
‫‪-‬‬
‫‪E.Coli ATCC 25922‬‬
‫اشریشیا‬
‫کلی‬
‫ادوارد سیال‬
‫تاردا‬
‫گونه های‬
‫کلبسیال‬
‫انتروباکتر‬
‫کلوآگا‬
‫انتروباکتر‬
‫آئروژنز‬
‫هافنیا آلوای‬
‫سیترو باکتر‬
‫فروندی‬
‫پروتئوس‬
‫ولگاریس‬
‫پروتئوس‬
‫میرابیلیس‬
‫پروتئوس‬
‫مورگانی‬
‫پروتئوس‬
‫رتگری‬
‫واکنش‬
‫حرکت‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+a‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫گاز(گوکز)‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+a‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫الکتوز‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫ساکاروز‬
‫‪+/-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+‬‬
‫(‪)+‬‬
‫‪-‬‬
‫(‪)+‬‬
‫مانیتول‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫اندول‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫متیل رد‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-a‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫وژ‪-‬پروسکوئر‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+a‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫سیترات‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+a‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫اوره آز‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪SH2‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫دکربوکسیالز‬
‫لیزین‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+/-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫پیگیری کشت ادرار با توجه به تعداد‬
‫کلونی‬
‫‪≤ 1000 Nogrowth‬‬
‫‪≤ 10000 Contamination‬‬
‫‪10000 – 100000 Possible infection‬‬
‫‪≥ 100000 Probably infection‬‬
‫وجود ‪ 100000‬يا بیشتر کلونی به ازای هر میلی لیتراز ادرار به‬
‫عنوان عفونت در نظر گرفته می شود ولی در مواردی که ذکر‬
‫می گردد با تعداد کلونی کمتر نیز کشت قابل بررسی است‪.‬‬
‫* درصورتیکه نمونه ادرار با سرنگ از مثانه آسپیره شده باشد تعداد‬
‫کلونی هر چقدر باشد قابل ارزش بوده و می بايست آزمايش ادامه يابد‪.‬‬
‫* اگر تعداد کلونی کمتر از ‪ 10000‬باشد بررسی بیشتر الزم نیست‬
‫جزء در مواردی که کلونی استاف اورئوس باشد که در اين صورت‬
‫تعداد هر چقدر باشد دارای ارزش بوده وپیگیری می گردد‪.‬‬
‫* در خانم ها با فعالیت جنسی که سندرم حاد يوترال دارند وجود تعداد‬
‫‪ 100‬کلونی به همراه پیوری به عنوان عفونت ادراری در نظر گرفته‬
‫شده و روند کشت ادامه می يابد‪.‬‬
‫در صورت رشد چند نوع کلونی رعایت‬
‫نکات زیر ضروری است‬
‫‪-1‬نوع میکروب را بر اساس اهمیت آن مشخص می کنیم‬
‫‪-2‬با توجه به تعداد کلونی هر کدام از باکتری ها که دارای تعداد‬
‫کلونی بیشتری بود گزارش می گردد (در صورتی که‬
‫باکتری ها ازنظر اهمیت در يک رده باشند)‪.‬‬
‫‪-3‬رشد سه نوع ويا بیشتر کلونی بر روی محیط کشت نشانه‬
‫آلودگی است‪.‬‬
‫ارتباط آنالیز میکروسکوپی رسوب ادرار و‬
‫کشت ادرار‬
‫‪-1‬در بیماران خانم ‪ Ep=8-10 WBC=3-4‬و ‪ Bac=mod‬وکلونی ‪ 10000-100000‬ومیکروب گرم مثبت باشد ‪،‬اگر باسیل باشد فلور نرمال واگر کوکسی باشد‬
‫بايد نوع میکروب مشخص و آنتی بیوگرام گردد‪.‬‬
‫‪-2‬چنانچه ‪WBC=1-2‬و ‪ EP=8-10‬وباکتری ‪ 10000 -100000‬باشد فقط شکل باکتری وازنظر گرم مثبت يا منفی بودن گزارش می گردد‪.‬‬
‫‪ -3‬چنانچه ‪ WBC=0-1‬و‪ RBC=0-1‬و‪ EP=Many‬باشد و باکتری کمتر از ‪100000‬باشد آلودگی محسوب می شود‬
‫‪UTI‬حقیقی با کانت کمتر از ‪ 100000‬در موارد زیر دیده می شود‬
‫‪-1‬نوزادان وبچه ها‬
‫‪-2‬مردان‬
‫‪-3‬فردی که کاتتر دارد‬
‫‪-4‬کسی که جديداٌ آنتی بیوتیک مصرف نموده است‬
‫‪-5‬مصرف باالی مايعات‬
‫‪-6‬همراه پیوری‬
‫‪-7‬انسداد ادراری‬
‫‪ -8‬پیلونفريت اکتسابی ناشی از هماتوژنوس به دلیل قارچ واستاف‬
‫اورئوس‬
‫در اوايل عفونت ادراری ممکن است گلبول سفید در ادرار‬
‫نباشد ولی باکتری وجود داشته باشد در اين حالت‬
‫باکتريوری بدون عالمت داريم مثالٌ در سودومونا ‪E.Coli‬‬
‫و‬
‫مواردی که باکتری در ادرار نیست ولی‬
‫گلبول سفید وجود دارد‬
‫‪-1‬آنتی بیوتیک مصرف شده است‬
‫‪-2‬باکتريهايی مانند بروسال که محیط اختصاصی وزمان‬
‫انکوباسیون بیشتری می خواهند ودر کشت ديده نمی شوند‪.‬‬
‫‪-3‬مصرف زياد مايعات باعث کاهش تعداد باکتری می شود‪.‬‬
‫‪ -4‬افرادی که سنگ ادراری دارند تجمع باکتری پشت سنگ‬
‫ها باعث سندرم حاد مجرامی شود‪.‬‬
‫تشخیص افتراقی کوکسی های گرم‬
‫مثبت‬
‫‪ -1‬انجام تست کاتاالز ‪:‬‬
‫استاف ها کاتاالز مثبت و استرپ کاتاالز منفی می باشد‬
‫استرپ ها از نظرهمولیز به سه دسته ‪:‬آلفا ‪ ،‬بتا و گاما همولیز‬
‫تقسیم می شوند ‪.‬‬
‫مهمترين استرپ ها در دسته آلفا همو لیز استرپ پنومونیه می‬
‫باشد که به اپتوچین حساس است و استرپ ويريدنس که به‬
‫اپتوچین مقاوم می باشد ‪.‬‬
‫جدول تشخیص افتراقی استرپ ها‬
Organism
GroUp A
Group B
Group
C.G
Group D
enteroco
ccus
Group D
non En.
Sterpto.
Viridans
Sterpto.
Pneumon
iae
Hemolyse
‫بتا‬
‫هیچکدام‬،‫بتا‬
‫بتا‬
، ‫ بتا‬،‫آلفا‬
‫هیچکدام‬
، ‫آلفا‬
‫هیچکدام‬
، ‫آلفا‬
‫هیچکدام‬
‫آلفا‬
Baciteracin
S
R
R.S
R
R
R.S
R.S
SXT
R
R
S
R
S
S
S
Optochin
R
R
R
R
R
R
S
Camp
-
+
-
-
-
-
-
Bile Esculin
-
-
-
+
+
-
-
Test
‫استاف و میکروکوک‬
‫استاف ومیکروکوک هردو کاتاالز مثبت‬
‫می باشند ولیکن میکروکوک ها به شدت‬
‫کاتاالز مثبت هستند ‪.‬‬
‫* میکروکوک اکسیداز مثبت و استاف‬
‫اکسیداز منفی می باشند‪.‬‬
‫ساخت معرف اکسیداز‬
‫‪ 0.1‬گرم از پودر تترامتیل پارافنیل دی آمین دی‬
‫هیدروکلريد ‪ 10 +‬میلی لیتر آب مقطر‬
‫محلول تیهه شده يک هفته ماند گاری دارد‪.‬‬
‫تشخیص افتراقی سه جنس مهم‬
‫استافیلوکوک‬
‫ساپروفتيکوس‬
‫اپيدرميدیس‬
‫اورئوس‬
‫خصوصيات‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫کواگوالز‬
‫‪-‬‬
‫‪-، +‬‬
‫‪+‬‬
‫همولیز‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫تخمیر گلوکز در شرايط‬
‫بیهوازی‬
‫مقاوم‬
‫مقاوم‬
‫حساس‬
‫حساسیت به باسیتراسین‬
‫مقاوم‬
‫حساس‬
‫حساس‬
‫حساسیت به نووبیوسین‬
‫خاکستری ‪ ،‬سفید‪ ،‬زرد‬
‫پررنگ‬
‫سفید‬
‫زرد طالئی‬
‫پیگمان‬
‫متغیر‬
‫متغیر‬
‫‪+‬‬
‫تخمیر مانیتول در شرايط‬
‫هوازی‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫تخمیر مانیتول در شرايط‬
‫بیهوازی‬
‫استاف اپیدرمیديس به پلی میکسین ب‬
‫مقاوم ولی ساپروفتیکوس حساس است‪.‬‬
‫تذکر ‪:‬‬
‫‪ -1‬برای انجام تست کاتاالز بهتر است کلنی از روی محیط نوترينت آگار برداشته‬
‫شود ولی اگر از محیط بالد آگار استفاده می شود از سطح کلونی برداشته شود‬
‫‪(.‬چون گلبول قرمز دارای آنزيم کاتاالز می باشد و نتیجه مثبت کاذب می شود‪).‬‬
‫‪-2‬برای تست کاتاالز از آب اکسیژنه ‪ %3‬استفاده می شود ‪.‬‬
‫‪ -3‬آنس يا ابلیکاتور مورد استفاده جهت برداشت کلونی بايد از جنس غیر از فلز‬
‫باشد‪.‬‬
‫جدول آنتی بیوتیکها‬
Table 2
Zone Size Interpretive Chart for Bauer-Kirby Test
R = ‫مقاوم‬
I = ‫متوسط‬
MS = ‫نیمه حساس‬
S = ‫حساس‬
antimicrobial
agent
disc code
R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
amikacin
AN-30
15
15-16
-
16
amoxicillin/
clavulanic acid
- staphylococci
AmC-30
19
-
-
20
amoxicillin/
clavulanic acid
- other organisms
AmC-30
13
14-17
-
18
ampicillin
- staphylococci
AM-10
28
-
-
29
ampicillin
- G- enterics
AM-10
11
12-13
-
14
carbenicillin
Enterobacteriacea
e
CB-100
17
18-22
-
23
carbenicillin
- Pseudomonas
CB-100
13
14-16
-
17
cefazolin
CZ-30
14
15-17
-
18
cefotaxime
CTX-30
14
-
15-22
23
cefotetan
CTT-30
12
-
13-15
16
‫جدول آنتی بیوتیک ها‬
antimicrobial
agent
disc code
R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
cefoxitin
FOX-30
13
-
15-17
18
ceftazidime
CAZ-30
14
15-17
-
18
ceftizoxime
- Pseudomonas
ZOX-30
10
-
11
-
ceftizoxime
- other organisms
ZOX-30
14
-
15-19
20
ceftriaxone
CRO-30
13
-
14-20
21
cephalothin
CF-30
14
15-17
-
18
chloramphenicol
C-30
12
13-17
-
18
ciprofloxacin
CIP-5
15
16-20
-
21
clindamycin
CC-2
14
15-20
-
21
doxycycline
D-30
12
13-15
-
16
antimicrobial
agent
disc code
R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
erythromycin
E-15
13
14-22
-
23
gentamicin
GM-10
12
13-14
-
15
imipenem
IPM-10
13
14-5
-
16
kanamycin
K-30
13
14-17
-
18
nalidixic acid
NA-30
13
14-18
-
19
nitrofurantoin
F/M-300
14
15-16
-
17
norfloxacin
NOR-10
12
13-16
-
17
oxacillin
- staphylococci
OX-1
10
11-12
-
13
penicillin
P-10
28
-
-
29
streptomycin
S-10
11
12-14
-
15
antimicrobial
agent
disc code
R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
sulfamethoxazole
+ trimethoprim
SXT
10
11-15
-
16
tetracycline
Te-30
14
15-18
-
19
trimethoprim
TMP-5
10
11-15
-
16
vancomycin
Va-30
9
10-11
-
12
ticarcillin
TIC-75
11
12-14
-
15
tobramycin
NN-10
12
13-14
-
15
‫دیسک های آنتی بیوتیکی مورد استفاده در‬
‫انواع نمونه ها بر حسب نوع باکتری‬
‫‪ -1‬در مواردی که استاف از نمونه ادرار جدا گردد از ديسک های زير استفاده‬
‫می شود‪.‬‬
‫آمپی سیلین –نیتروفورانتوئین‪ -‬کوتريموکسازول‪ -‬سفالکسین يا سفالوتین – جنتامايسین‬
‫– نوروفلوکساسین – سیپروفلوکساسین‬
‫تمام استاف ها به وانکومايسین وبیشتر آنها به ريفامپین حساسند‪.‬‬
‫‪-2‬در مواردی که استرپ از نمونه ادرار جدا گردداز‬
‫ديسک های زير استفاده می گردد‪:‬‬
‫آمپی سیلین – نیترو فورانتوئین – کوتريموکسازول – تتراسايکلین – سفالکسین‬
‫يا سفالوتین – نورفلوکساسین‬
‫در حال حاضر در مورد استرپ پیوژن گروه آ سويه مقاوم به پنی سیلین‬
‫گزارش نشده است ولذا نیازی به آنتی بیوگرام نیست‬
‫‪-3‬درمواردی که‪E.Coli- pro.-Kle.‬‬
‫از نمونه جدا گردد از ديسک های زير استفاده می شود‬
‫آمپی سیلین‪ -‬کوتريموکسازول – نیتروفورانتوئین‪ -‬سفالکسین يا سفالوتین‬
‫– نالیديکسیک اسید‪ -‬تتراسايکلین‪ -‬جنتامايسین‪ -‬آمیکاسین‪-‬‬
‫نورفلوکساسین‪ -‬سفتوتاکسیم يا سفتی زوکسیم‪.‬‬
‫‪-4‬در مواردی که سالمونال از نمونه بیمار جدا گردد از‬
‫ديسک های زير استفاده می گردد‪:‬‬
‫آمپی سیلین – کوتريموکسازول – کلرامفنیکل – سفوتاکسیم يا‬
‫سفتی زوکسیم – سیپروفلوکساسین – جنتامايسین‬
‫‪ -5‬در مواردی که شیگال از نمونه بیمار جدا گردد‬
‫ازديسک های زير استفاده می شود‪:‬‬
‫آمپی سیلین – کوتريموکسازول – تتراسايکلین – سفوتاکسیم يا‬
‫سفتی زوکسیم – نالیديکسیک اسید – نورفلوکساسین‬
‫‪-6‬در مواردی که سودوموناس وديگر باکتری های غیر تخمیری‬
‫از نمونه ادرار جدا گردد از ديسک های زير استفاده می شود‪:‬‬
‫جنتامايسین – آمیکاسین – کارپنی سیلین – تیکارسیلین يا پی‬
‫پیراسیلین – سفتازيديم يا سفتی زوکسیم –نورفلوکساسین‬
‫آزمایشات حساسیت ضد‬
‫میکروبی(آنتی بیوگرام)‬
‫به دو روش انجام می شود‪:‬‬
‫‪ -1‬روش رقیق سازی که يک روش کمی و وقت‬
‫گیر است و استفاده روتین ندارد ‪.‬‬
‫‪ -2‬روش ‪:Disk Diffusion‬‬
‫‪Disk Diffusion‬‬
‫عملی ترين وساده ترين روش تعیین حساسیت داروئی باکتريها روش‬
‫انتشار از ديسک می باشد در اين روش میزان برداشت باکتری بايد از‬
‫نظر کدورت با لوله نیم مک فارلند برابر باشد ( لوله نیم مک فارلند حاوی‬
‫‪ 0.6‬میلی لیتر کلرور باريم ‪ %1‬که بايستی با اسید سولفوريک ‪ %1‬به‬
‫حجم ‪ 100‬میلی لیتر رسانیده شود)محلول فوق را به میزان ‪ 4-6‬میلی لیتر‬
‫در لوله تقسیم کرده ودرب لوله را با درب های سر پیچ دار بسته وبدين‬
‫ترتیب می توان آنها را در يخچال و در تاريکی به مدت ‪ 6‬ماه نگهداری‬
‫نمود‪.‬‬
‫با افزودن ‪ 4-5‬کلونی يکسان به مقداری سرم فیزيولوژی‬
‫استريل می توان کدورت معادل نیم مک فارلند را تهیه‬
‫نمود‪.‬سپس يک سواپ استريل را داخل لوله نموده ومايع‬
‫اضافی را با جدار لوله می گیريم ‪ ،‬سواپ را در جهات‬
‫مختلف بر روی پلیت آگار مولر هینتون حرکت داده وحتی‬
‫دور پلیت را هم آغشته می کنیم‬
‫حداکثر بعد از ‪ 5‬دقیقه پس از تلقیح میکروب به محیط آنتی‬
‫بیوگرام ديسک های آنتی بیوتیک را با فاصله ی مناسب از‬
‫يکديگر قرار می دهیم و به مدت ‪ 16-18‬ساعت در انکوباتور‬
‫میگذاريم وبعد از آن قطر هاله عدم رشد را با خط کش اندازه‬
‫گیری نموده و باجدول مقايسه نموده و بصورت حساس ‪،‬‬
‫بینابین و مقاوم گزارش می کنیم‬
‫تذکر‪:‬‬
‫‪ -1‬ديسک های آنتی بیوگرام از دور پلیت ‪ 9‬میلی متر فاصله داشته باشند و فاصله بین‬
‫دو ديسک حداقل ‪ 14‬میلی متر باشد‪.‬‬
‫‪-2‬محیط مورد استفاده برای آنتی بیوگرام مولر هینتون با پی اچ ‪ 7/2 -7/4‬و‬
‫عمق محیط ‪ 4‬میلی متر( در پلیت های ‪ 15‬سانتی ‪ 60 -70‬میلی لیتر و در پلیت‬
‫های ‪ 10‬سانتی حدود ‪ 25 -30‬میلی لیتر محیط اضافه گردد‪).‬جهت جلوگیری‬
‫از خشک شدن محیط بايد پلیت ها را در کیسه های پالستیکی نگهداری کرد‪.‬‬
‫‪-3‬پلیت های که حاوی محیط با عمق کمتر از ‪ 4‬میلی متر می باشند باعث ايجاد‬
‫محدوده حساسیت بزرگتر از حد معمول می گردند ودر موارد ی که محیط‬
‫ضخیم باشد فرم های مقاوم ديده می شود يعنی انتشار خوب صورت نمی گیرد‪.‬‬
‫‪-4‬اگر غلظت باکتری کم باشد بیشتر نتايج را حساس گزارش می کنیم ( مقاوم را‬
‫اشتباها ٌ حساس گزارش می شود) زيرا منطقه ممانعت از رشد خیلی زياد است‪ .‬اگر‬
‫غلظت در کشت‬
‫زياد باشد منطقه ممانعت از رشد کم و بیشتر نتايج را مقاوم‬
‫گزارش می کنیم ‪.‬‬
‫‪ -5‬ديسک های آنتی بیوگرام بايستی در فريزر در دمای منهای ‪ 20‬درجه نگهداری‬
‫گردد وقبل از استفاده حدود يک ساعت قبل در دمای محیط قرار گیرد در غیر اين‬
‫صورت موجب کاهش در نفوذ آنتی بیوتیک ديده می شود‪.‬‬
‫‪ -6‬زمان قرار دادن ديسک ها نیز اهمیت دارد ‪.‬در زمان طوالنی فرصت تکثیر باکتری‬
‫ها قبل از قرار دادن ديسک وجود دارد که باعث کاهش قطر منطقه می گردد‪.‬‬
‫‪-7‬اگر ديسک در قسمتی از محیط افتاد آنرا همانجا قرار دهید‬
‫‪-8‬اگر پس از ‪ 24‬ساعت باکتری مورد نظر روی محیط مولررشد نکرد‬
‫‪ ،‬باکتری گرم منفی بود روی ای ام بی و اگر گرم مثبت بود روی‬
‫بالدآگار آنتی بیوگرام گردد‪.‬‬
‫از توجه شما متشکرم‬

similar documents