Efeitos do cortisol exógeno sobre o eixo GH/IGF-I/ IGFBP em Bagre de canal Ictalurus punctatus Brian C. Peterson ∗, Brian C. Small. 2005 Departamento de agricultura dos Estados Unidos. Catfish Genetics Research Unit. Stoneville, Meade County, South Dakota. Luz Natalia Franco Montoya Doutoranda em Zootecnia UNESP – Jaboticabal . Otubro de 2012 INTRODUÇÃO Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) Introdução Aspectos giráis do GH Growth hormone (GH) é um hormônio pluripotencial produzido na glándula pituitaria em teleosteos como me outros vertebrados. O GH atua por união a receptor especifico transmembrana os GHR que se encontram nos tecidos alvos. Introdução Aspectos giráis do GH Em peixes o GH atua na maioria de processos fisiológicos do corpo. Funções •Balance iônico e osmótico •Metabolismo de lipídeos, proteínas e carboidratos •Crescimento esquelético e de tecidos moles •Reproduction •Função imune Aspectos comportamentais como: •Apetite •Procura de alimento •Agressão •Evitar o predador Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) Importante eixo no processo de crescimento de mamíferos, aves e peixes Figado: Função endócrina (origem principal) Produção de IGF-I Tecidos extra-hepáticos: Funções autócrina/parácrina em tecidos perifericos. Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) Principalmente por: Regulação de IGF-I •Secreção de hipofisiaria de GH •Proteínas de ligação especifica a IGF, conhecidas como IGHBPs Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) •Prolongação da vida meia dos IGF Funções das IGFBPs •Coordenação e transporte dos IGF no sangue e nos capilares dos tecidos alvo. Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) Tipos de IGFBPs Mamíferos IGFBPs 1 IGFBPs 2 IGFBPs 3 IGFBPs 4 IGFBPs 5 IGFBPs 6 •Nos mamíferos a mais abundante em soro é a tipo 3 Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) •Se ligam aos IFG Mecanismos de ação das IGFBPs •Alta afinidade e especificidade •Algumas tem seus próprias atividade biológicas intrínsecas. Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) Conformação do complexo ternário •Este complexo esta formado pela união de: •IGF •IGFBPs •Glucoproteina kDa 85 chamada subunidade ácido-lábil (ALS) Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) •Prolonga a vida media do IGF-I Complexo ternário Função •Livre: 10min •Unida: 18hrs •A fim de estabilizar e manter o nível no plasma Introdução Eixo Hipotálamo (H)/ Hormônio de crescimento (GH)/ Fator de Crescimento similar à insulina (IGF-I) •Tem sido achadas 3 a 4 de 20 a 50 Kda de peso molecular IGFPBs em Teleosteos •Função similar á descrita em mamíferos Introdução Ação dos glicocorticoides no Eixo H/ GH/ IGF-I /IGFPB •Níveis suprafisiológicos de glicocorticoides têm mostrado efeitos inibitórios no crescimento em mamíferos. •Redução do gene IGF-I Mecanismos •Bloqueando a produção de GH •Redução da síntese de receptores de GH Introdução Ação dos glicocorticoides no Eixo H/ GH/ IGF-I /IGFPB, em teleosteos. •Níveis suprafisiológicos de glicocorticoides têm mostrado efeitos inibitórios no crescimento em peixes teleósteos. •Redução no crescimento somático em peixes tratados com cortisol foi achado em estudos com: Introdução Ação dos glicocorticoides no Eixo H/ GH/ IGF-I /IGFPB, em teleosteos. Aumento das IGFBPs de baixo peso molecular Redução de IGF-I no plasma IGF-I mRNA no fígado foi observado Mecanismos horas após administração de cortisol. só 24 e 48 Estudos em Não alterou níveis de GH. Este estudo sugere que o Tilápia tratada cortisol reduz a sensibilidade dos IGF ao GH. com cortisol Kajimura et al 2003 Como em mamíferos estes são mecanismos pelos que o cortisol pode inibir o crescimento titulo Objetivos Efeitos do cortisol exógeno sobre o eixo GH/ IGF-I / IGFBP em Bagre de canal Ictalurus punctatus O presente estudo busca compreender melhor os efeitos dos glicocorticoides no eixo GH/IGF-I/IGFBP. Serão examinados os efeitos em vivo do cortisol exógeno a longo prazo em Bagre de canal. Serão medidos os níveis plasmáticos de IGF-I, IGFBPs, e níveis de IGF-I mRNA no fígado e GH na pituitária. MATERIAL E MÉTODOS Material e métodos Efeitos do cortisol exógeno sobre o eixo GH/ IGF-I / IGFBP em bagre do canal Catfish used in this study were from the National Warmwater Aquaculture Center. Caraterísticas experimentais primer estudo Peso Peixes L/Aquário Densidade Adaptação T /água Sistema Fotoperíodo pH O2 mg/L 30.6±3.0 g 76L água 7 peixes por aquário 2 semanas 26.0 ◦C Fluxo continuo 14 hr Luz 10 hr escuro ∼8.5 >5.0 mg/l Material e métodos Efeitos do cortisol exógeno sobre o eixo GH/ IGF-I / IGFBP em bagre do canal Tratamentos primeiro estudo Grupo N Descrição Duração Dose Grupo I 15 Alto nível de cortisol na dieta 4 semanas * +400mg/kg/dia Grupo II 15 Baixo nível de cortisol na dieta 4 semanas * +200mg/kg/dia Controle 15 Sem cortisol na dieta 4 semanas *=Alimento comercial (36% crude protein) Material e métodos Efeitos do cortisol exógeno sobre o eixo GH/ IGF-I / IGFBP em bagre do canal Caraterísticas experimentais segundo estudo: medição de nives de Cortisol em sangue Peso Peixes L/Aquário Densidade Adaptação T /água Sistema Fotoperíodo pH O2 mg/L 112.4 g 6 aquários com 76L água 9 peixes por aquário 2 semanas 26.0 ◦C Fluxo continuo 14 hr Luz 10 hr escuro ∼8.5 >5.0 mg/l Material e métodos Efeitos do cortisol exógeno sobre o eixo GH/ IGF-I / IGFBP em bagre do canal Tratamentos segundo estudo: : medição de nives de Cortisol em sangue Grupo N Descrição Duração Dose Grupo I 12 Alto nível de cortisol na dieta 24 hrs * +400mg/kg/dia Grupo II 12 Baixo nível de cortisol na dieta 24 hrs * +200mg/kg/dia Controle 12 Sem cortisol na dieta 24 hrs *=Alimento comercial (36% crude protein) Os peixes foram pegos pra coleta de sangue a 0, 0.5, 2, 4, 7, 10, 15, 20, e 24 h, após os tratamentos. Para medição do nível de cortisol. Material e métodos Coleta de dados biométricos e amostras Animais anestesiados com metomidate hydrochloride 0,6mg/L. Dados biometricos: peso g. compromento mm. Apos coleta de amostras eutanasia com 200 mg/l solution of tricaine methanesulphonate. Dissection Material e métodos Coleta de amostras e analises feitos Amostra Descrição da coleta Plasma sanguíneo Vasculatura caudal, siringas com heparina Pituitaria e Figado Dissection Analise Cortisol, IGF-I, usando Kits comerciais IGFBPs, Usando Western Ligand Blotting Isolamento de RNA Medição de GH and IGF-I mRNA Real-time PCR , para a expressão génica de IGF-I, GH. Material e métodos Modelo experimental e Analises estatísticas O modelo experimal incluiu, efeitos do tratamento em: Estudo I: Peso e ingestão de alimento, Eficiencia alimentaria Expressão gênica nos tecidos de GH, IGF, e IGFBP Níveis plasmáticos de IGF-I Estudo II: incluiu efeitos no tempo Todos os dados obtidos no presente estudo foram submetidos a analise de varianza ANOVA. Diferencias significativas quando (P < 0.05) Cada aquário serveu como unidade experimental para cada variavel medida. resultados resultados Expressão gênica de IGF-I e GH resultados Ganho de peso, Ingestão de alimento, Rata de conversão alimentar, Concentração plasmática de IGF-I e GH Final weights of the Control, High, and Low fish were 78.7, 35.3, and 39.9 g, respectively (P < 0.05). resultados Levels of a 20-kDa insulin-like growth factor binding protein in Control-, Low-, and High-treated catfish. resultados Liver IGF-I mRNA expression in Control-, Low-, and High-treated catfish. resultados Pituitary GH mRNA expression in Control-, Low-, and High-treated catfish resultados Plasma cortisol levels in Control-, Low-, and Hightreated catfish Discussão Discussão O presente estudo ... Mostra que administração de cortisol gera uma inibição significante no crescimento somático em Bagre de canal. Peso final foi reduzido em aprox. 50% nos peixes tratados. Em contraste com outros estudos com peixes que mostraram diminuição na taxa de crescimento quando tratados como cortisol. Barton B.A., et al 1987 Bernier NJ, et al 2004 Discussão A administração de cortisol exógeno no alimento inibe a ingestão de comida em aprox. 30% sem diferencia significativa na eficiência alimentar. Os efeitos do cortisol na ingestão de alimento são ambíguos. Por exemplo: Davis et al, 2004. Sem efeitos no Consumo de alimento Gregory and Wood , 1999 Cortisol implante reduz o consumo individual Bernier NJ, et al 2004 Aumento do consumo com low-cortisol diet e vrs. Discussão A hipótese deste estudo foi, sim a alteração no eixo GH/IGF-I/IGFBP, poderia ser um dos mecanismos por médio do que o cortisol inibe o crescimento. Resultado de esta pesquisa se mostrou claramente a relação entre o cortisol e o incremento da 20 kDa IGFBPs. Este resultado coincidiu com estudos prévios do mesmo grupo de pesquisa onde o incremento de cortisol gerou também aumento nos níveis plasmáticos de 20-kDa IGFBP em Catfish. Peterson BC, et al 2004 Discussão Kelley et al. 2001, compara 3 estados catabólicos em peixes: •Jejum •Untreated insulin-dependent diabetes mellitus •Estresse •Em todas as situações o nível de cortisol aumento e incrementaram uma e/ou duas IGFBPs (24 and 30 kDa), dependeu da espécie. Teleosts fishes Kelley et al, 2001 Discussão Este estudo mostra como outros estudos em outros peixes, a relação do cortisol com 20 kDa IGFBP, Outras proteinas não mostraram diferencia com os tratamentos estabelecidos no presente estudo. (30 e 45 kDa) foram observadas sem alteração. Estudo com tilápia mostrou a relação entre o cortisol com quatro proteínas de ligação de baixo peso molecular IGFBPs (24, 28, 30, and 32 kDa). Kajimura et al, 2003 Discussão Das três IGFBPs observadas neste estudo, 35 e 45 kDa IGFBPs foram as mas abundantes no plasma de todos os peixes. O cortisol não afeto os níveis destas proteínas no plasma. Baseados no peso molecular a 45 kDa IGFBP dos peixes pode correspondes a IGFBP 3 dos mamíferos. Níveis de IGFBP-3 e mRNA nos mamíferos reduz por glucocorticoides. Delany AM, et al 2001 Rodgers BD, et al 1995 Cheng RS, et al, 2002 Kelley KM, et al, 2002 Discussão Em tilapia 40 e 42 kDa IGFBPs, diminuiram com tto de cortisol. Small BC. Et al, 2004. Anteriores estudos não mostraram alterrações no nível de 45kDa IGFBP, em Bagre de canal, em anabolic (GH tto) or catabolic (jejum) condições. Peterson BC, et al 2004. It is not apparent why we did not detect a decrease in the 45 kDa IGFBP in cortisol-treated catfish fish, similar to that observed in tilapia Discussão O presente estudo mostra, um increment só em 20KDa IGFBP em condições catabólicas em Bagre de canal. Peterson BC, et al 2004. Peterson BC, et al 2005. O papel das proteinas de ligação (IGFBPs) de baixo peso molecular, ainda não é claro, mas podem server para diminuir prossesos anabolicos de alto consumo de energia durante circunstacias catabolicas com o jejum. Kelley KM, et al 2002 Lee PDK, et al 1997 Discussão Baseados na comparação do peso molecular tem sido proposto que ≤31-kDaIGFBPs em peixes podem ser a contraparte de IGFBP-1 or -2. nos mamíferos. Nos mamíferos adultos níveis de IGF-I e IGFBPs são afetados em condiçõies catabolicas ou condições estressantes como o jejum. Lee PDK, et al 1997 Thissen JP, et al 1994 IGFBP-1 demonstrou inibir a ação do IGF em numerosas in vitro e in vivo em estudos com animais. Lee PDK, et al 1997 Além disso, o gene da IGFBP-1 possui elementos de resposta a glicocorticóide, e os esteróides podem, potencialmente aumentar os níveis de IGFBP-1 Lee PDK, et al 1997 Discussão Os mecanismos através dos quais a IGFBP-1 ou -2 inibem a ação de IGF-I não são claras, mas podem incluir sequestro de IGF-I no meio extracelular por afinidade de alta ligação a IGF e restringir funções anabolizantes costosas durante momentos de estresse ou deficiências nutricionais Collett-Solberg PF, & Cohen P. 2000 KelleyKM, et al 2001 Discussão No presente estudo foi observada a redução de IGF-I no plasma, depois de dieta com cortisol do mesmo modo que em outras espécies de animais A diminuição de IGF-I no plasma causada pelo cortisol na dieta pode ser devido em parte à supressão de eventos post- transcrição na expressão do IGF-I. Além disso, o aumento na taxa de depuração do IGF-I circulante em peixes tratados com cortisol, pode também ter sido envolvido. Conclusões O presente estudo mostrou que o cortisol administrado na dieta de Bagre de canal durante 4 semenas pode: Diminuir o crescimento corporal Diminuir o consumo de alimento Incrementar a 20 kDa IGFBP Diminuir os níveis plasmáticos de IGF-I Um dos mecanismos do cortisol para inibir o crescimento em Bagre de canal e o aumento das IGFPBs de baixo peso molecular as quais podem ter efeito inibitorio sobre a ação dos IGF-I’s. Esta pesquisa apresenta evidencia adicional sobre a conservação do eixo de crescimento GH/IGF-I/IGFBP em peixes