Toxicologia Forense

Report
Análises Forenses
Prof.Ms.Emerson L.B.Lourenço.
Toxicologia Forense
• Definição: Ciência que detecta e identifica a
presença de drogas e venenos em fluídos
corpóreos, tecidos e órgãos.
Toxicologia Forense
• Funções diversas;
• Toxicologia Forense x Toxicologia Analítica;
• Várias matrizes para análises;
• Métodos químicos sofisticados (derivação
química, cromatografia, espectrometria de
massa);
Compostos Voláteis
• Compostos da forma liquida que podem ser
detectadas por técnicas de cromatografia
liquida ou gasosa, quando as matrizes podem
sofrerem métodos de extração apropriados.
• Extrações Liquído-Liquído, head space, Micro
extração em fase sólida e extração em fase
sólida.
Substâncias Corrosivas
• Incluem ácidos minerais e bases;
• Vários agentes corrosivos são constituintes
normais dos tecidos;
• Modificações das concentrações químicas no
plasma podem determinar as lesões;
Metais
• Clássicos procedimentos de separação de
matrizes orgânicas são utilizados para
determinação de metais ( Ex: agentes químicos e
oxidação térmica);
• Técnicas analíticas empregadas ( Ex: AAS, MEV e
ICP-MS);
• Diferentes formas
dimetilmercúrio);
de
metais
(
Mercúrio,
Componentes orgânicos não voláteis
• Drogas prescritas e ilícitas, praguicidas,
produtos naturais, poluentes e compostos
industriais;
• Dificuldade de Separação....
A
N
Á
L
I
S
E
S
Papel da Toxicologia analítica
BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO NO FÍGADO E MEDULA ÓSSEA
FÍGADO
CytP450
CytP450
fenol
hidroquinona
Benzeno
[O]
[O]
MEDULA ÓSSEA
Prostaglandina sintetase
Hidroquinona
radical fenoxil
(aplasia de medula )
Como determinar?
O que procurar nestas amostras?
CH2 CH N
CH3
metanfetamina
CH3
OH
H
CH2 CH N
CH3
CH3
CH2 CH N
CH3
femproporex
CH2CH2CN
H
H
efedrina
anfetamina
CH2 CH N
CH3
H
H
OH
CH CH N
CH3
H
H
fenilpropanolamina
ESTERÓIDES ANABÓLICOS
ANDROGÊNICOS
OH
OH
HO
OH
H
O
O
1-Androstenodiol
Boldenona
OH
CH3
Clostebol
Cl
H5C2 OH
C CH
OH
H N
N
O
H
Estanozolol
Gestrinona
OH
O
O
Trembolona
Nandrolona
H5C2 OH
CH2CH3
OH
O
OH Oxabolona
O
THG
AGENTES ANABÓLICOS
1. Esteróides anabólicos androgênicos
Algumas dos esteróides mais utilizados:
- metandienona (Dianabol),
- cipionato de testosterona (Testosterona Depot, Sustanon)
- decanoato de nandrolona (Deca-durabolin, Durabolin)
- oxandrolona (Anavar)
- enantato de metenolona (Primobolan)
- estanozolol ( Winstrol)
- undecilenato de boldenona (Equipoise) - uso veterinário
Agentes anabólicos
1. Esteróides anabólicos androgênicos
Efeitos tóxicos
-Coletases e tumores no fígado, mais
freqüentemente com o uso de
derivados C-17 alquilados. Carcinomas
hepáticos associados aos E.A. não
produzem metástase e regridem após
a descontinuação do uso.
O ciclo letal de Andreas Munzer
0-10 semanas antes da competição:
-Efedrina, Aspirina, Valium, clembuterol,
hormônio da tireóide.
6-10 semanas antes da competição:
-2 inj. Testoviron 250mg (testosterona)
-1 inj. Parabolan (Trembolona)
- 30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-30 comp. Metandienona
-20 doses GH
-20 doses insulina
3-5 semanas antes da competição:
-3 inj. Masteron (Drostanolona)
-2 inj. Parabolan(Trembolona)
-30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-50 comp. Stromba (Estanozolol)
-2 inj. Stromba
-24 doses GH
-20 doses insulina
OUTROS: EPO, diuréticos
ESTERÓIDES ANABÓLICOS
ANDROGÊNICOS
Baixas concentrações
DETECÇÃO
URINA
O desafio dos anabolizantes
Conteúdo da seringa
18α-homo-pregna-4,9,11-trieno-17β-ol-3-ona
4,9,11- trieno-3-one
Designer steroids
Esteróides de desenho
Tetraidrogestrinona – Conclusões de Catlin et al.
i) Novo esteróide, nova “entidade química”.
ii) Sem registro de CAS.
iii) Nunca antes usado em humanos ou animais.
iv) Nunca testado em screening farmacológico.
v) Propósito único – burlar o exame de dopagem.
vi) “O” esteróide de desenho.
O desafio dos anabolizantes
Caracterização do THG
“CLUB DRUGS”: Freqüentadores de festas “raves”.
• MDMA: Ecstasy, pílula do amor.
•
•
•
•
•
•
GHB: “Ecstasy líquido”.
Cetamina: Special K, Kit kat.
Metamfetamina: Speed, Crystal, DOB.
LSD (Ácido, doce, ponto).
Fenciclidina: PCP.
Nitritos (Poppers).
Utilizadas em assaltos e estupros.
Efeitos: Incapacidade de reação e
amnésia retrógrada.
R
o
h
y
p
n
o
l
Flunitrazepam (FNZ)
FNZ ilícito
WWW.DEA.GOV
GHB
GHB
Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL).
GHB
Definição:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL.
Natural em SNC de mamíferos.
Estrutura similar ao neurotransmissor GABA.
Date rape drug (Relatos de uso em assaltos e
estupros).
Líquido ligeiram. Salgado, amargo e inodoro.
Popularizado na década de 1980 - realçar o efeito do etanol .
Uso crescente por todo o país.
Recentemente aprovado pelo FDA como tratamento
para narcolepsia.
Alguns congêneres: gama-Butirolactona (GBL) e 1-4 butanediol
(solventes industriais utilizados na limpeza de CDs, Impressoras).
GHB
Mecanismo de ação:
Receptores só no SNC, principalmente hipocampo.
• Liga-se fracamente em receptor GABA b.
• Depressor do SNC.
• Provoca liberação de opióides endógenos.
•
Farmacocinética:
GHB
•
Início de ação: 15-30 min e pico plasmático
em 25-45 min.
• Metabolizado em CO2 .
• GBL é convertido à GHB por via não enzimática.
• 1-4 butanediol é convertido à GHB pela álcool
desidrogenase.
• Efeito Bifásico. A ingestão concomitante de etanol, leva a
uma inibição competitiva pela álcool desidrogenase,
retardando a metabolização do 1-4 butanediol. Assim,
pode haver uma depressão inicial do nível de consciência
seguido por uma melhora quando o etanol é metabolizado
e logo em seguida evolução para coma com a
disponibilização da álcool desidrogenase.
DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4bromoamfetamina
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DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4bromoamfetamina
Derivado anfetamínico acrescido de um átomo de bromo (
responsável por potencializar o efeito da droga e por aumentar o
tempo de ação).
Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967.
Cápsula transparente com capacidade de 500 mg que contém cerca
de 1 a 1,5 mg da substância.
N
CH3
Éster metil ecgonina
O
C O CH
3
(15-35%)
OH
N
CH3
N
O
C O CH
3
Norcocaína
H
O
C O CH
3
O
O C
N
(2-6%)
O
C
OH
O
O C
OH
Cocaína
(3%)
CH3
Ecgonina
N
CH3
(1-8%)
O
C OH
O
Benzoilecgonina
O C
(15-50%)
Amostras
PRAGUICIDAS
•
•
•
•
a) Derivados do ácido fosfórico.
b) Derivados do ácido tiofosfórico.
c) Derivados do ácido ditiofosfórico.
d) Derivados do ácido fosfônico.
Derivados do ácido fosfórico.
Ex: Diclorvos,fosfamidon,Mevinfós, Monocrotofós.
Derivados do ácido Tiofosfórico.
Ex: Cloropirifós,Diazinon,Fention,Omeotoato,Paration metílico
Derivados do ácido Ditiofosfórico.
Ex:Azinfós,etion,forato,malation,tiometon
Derivados do ácido Fosfônico.
Ex:Triclorfon
Oral, respiratória e dérmica.
Biotransformação
Oxidação
Ligação ao sitio enzimático
x
Ácido Carbâmico
Aldicarb,Carbaril,Carbofuran
INSETICIDAS ORGANOCLORADOS
São compostos de estruturas cíclicas, bastante
lipofílicos e altamente resistentes aos
mecanismos
de
decomposição
do
ambiente.Os principais organoclorados com
atividade inseticida são:
•
•
•
•
a) Hexaclodienos e análogos.
b) DDT e análogos.
c) Ciclodienos.
d) Dodecacloro e clordecone.
DDT
2,2-BIS(P-CLORFENIL) 1,1,1 - TRICLOETANO
DDT
CICLODIENOS
Aldrin
Dieldrin
PIRETRÓIDES
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS EM ANÁLISES
TOXICOLÓGICAS
-A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de
operações unitárias necessárias para que determinada substância
(analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.
Típicas operações em preparação de
amostras:
1) Liberação dos analitos da amostra
2) Remoção de interferentes endógenos
3) Técnicas de extração
4) Aumento da seletividade e sensibilidade
1) Liberação dos analitos da matriz
-Como se encontra o analito na matriz?
-conjugado/livre
-matriz?
BIOTRANSFORMAÇÃO
Maconha - 9THC
CH3
O
C OH
OH
Ácido 11-nordelta-9-THCCOOH
OH
CH3
CH3
O
CH3
C5H11
CH3
Delta-9Tetraidrocanabinol
(THC)
O
C5H11
O
C O ácido glicurônico
OH
CH3
CH3
O
C5H11
Ácido 11-nor- delta -9
-THC-COOH
conjugado
SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS
-Hidrólise
-Alcalina
-Ácida
-Enzimática
HIDRÓLISE ALCALINA
-Exemplo
O
C O ácido glicurônico
OH
CH3
CH3
O
C OH
OH
60°C
NaOH
O
C5H11
Ácido 11-nor- delta -9
-THC-COOH
conjugado
CH3
CH3
O
Ácido 11-nordelta-9-THCCOOH
C5H11
HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA
-Vantagens:
-processo mais rápido
-custo baixo
- Desvantagens:
-degradação de analitos não estáveis
p.ex. benzodiazepínicos
HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA
Benzodiazepínicos
CH3
CH3 O
N
N H
HCl
N
Cl
100°C
Cl
15 min.
Diazepam
Benzofenona
O
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
Beta glucuronidase
Esteróides
Anabólicos
conjugados
55°C
1 hora
Esteróides
Anabólicos
livres
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
-Vantagens:
-não degrada os analitos
- Desvantagens:
-custo mais alto
-maior tempo de reação
-controle mais rigoroso das condições
-enzimas podem ser inibidas por substâncias
presentes nas amostras
-aconselhável o uso de controle
OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo
-Matriz complexa
-como retirar os analitos do cabelo?
-digestão da matriz (solução de NaOH 1M e temperatura 70°C
durante 20 minutos)
substâncias estáveis (THC, anfetaminas)
OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo
-E para substâncias não estáveis?
P.ex. cocaína
N
CH3
O
C O CH
3
O
O C
-Incubação em solução
ácida ou metanol durante
18 horas a 50°C
2) Remoção de interferentes
endógenos
Uma
muitos
matriz
biológica
componentes,
consiste
como
de
proteínas,
lipídios, carboidratos que podem interferir
na análise.
2) Remoção de interferentes
endógenos
A) Precipitação de proteínas:
A remoção de proteínas por desnaturação ou precipitação é muitas
vezes necessária principalmente em amostras como sangue total ou
plasma. A principal razão de remover proteínas é que elas podem
precipitar em contato com a fase móvel, obstruindo a coluna de
HPLC.
Métodos de precipitação:
a) com ácidos ( p.ex. ácido tricloroacético e ácido
perclórico)
-formam sais insolúveis com a forma catiônica
das proteínas em meio ácido
b) com solventes orgânicos
-solventes que são miscíveis em água como acetona,
metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a
solubilidade de proteínas.
Métodos de precipitação:
c) com sais metálicos: proteínas também podem ser
removidas da amostra com o uso de sais de zinco ou
cobre em condições alcalinas.
-não : analitos que complexam com metais.
b) sulfato de amônio: O sulfato de amônio é um
precipitante
relativamente
ineficiente:
<
75%
das
proteínas são removidas com a adição de 1,5mL de sol.
Saturada em 0,2ml de plasma. Entretanto, poderia ser
possível injetar o sobrenadante diretamente no HPLC.
Precipitação de pigmentos e sais biliares
Pigmentos urinários e sais biliares podem produzir altos
“backgrounds”que podem interferir na quantificação de analitos. A
remoção desses compostos com extensos esquemas de extração
podem ser relativamente difíceis ou demorados. Sua remoção pode
ser feita preferencialmente por precipitação com sais de chumbo.
3) Técnicas de extração
-Extração líquido-líquido (LLE)
-Extração em fase sólida (SPE)
-Extração por head space (HS)
-Micro extração em fase sólida (SPME)
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
Solvente
orgânico
urina
Drogas/
metabólitos
urina
Agitação
Centrifugação
Separação da fase
orgânica
extrato
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
• substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nor-delta -9-THCCOOH
O
C OH
O
H+
C OH
OH
Forma
nãoionizada
OH
CH3
O
CH3
C5H11
O
C O
CH3
CH3
O
C5H11
ácido 11-nor-delta 9-THC-COOH
OH
OH-
CH3
CH3
O
Forma
ionizada
C5H11
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
• substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas
CH2 CH N
CH3
Anfetamina
H
H+
CH2
H H
+
CH N
H
CH
3
Forma ionizada
H
OH-
CH2 CH N
CH3
H
H
Forma não-ionizada
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
= molécula de água
EFEITO “SALTING OUT”
CH2 CH N
CH3
Na+
H
H
Cl-
+
NaCl (cloreto de sódio)
CH2 CH N
CH3
H
H
EXTRAÇÃO
(fase sólida)
2,5mL Amostra
+ 2,5mL água +
PI + 2mL
tampão fosfato
2mL Metanol +
2mL tampão
fosfato
3mL água +3mL
HCl (0,1M),
secagem (5min)
+ 9mL metanol
2mL
diclorometano/
isopropanol /
NH3 (80:20:2)
BE
PI
Interf.
COC
1
2
3
4
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)
C8
Octil
Si
PH
Fenil
CH
Ciclo
hexil
Si
Si
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)
Si
CN
Cianopropil
C N
H O
NH2
Aminopropil
2OH
Diol
Si
O
OH
Si
O
H
H
NH
NH
H
H
O
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática)
O
CBA
Ácido
carboxílico
Si
C
O-
+
NH3
R
SCX
Si
Ácido
benzenosulfônico
SAX
Trimetil
aminopropil
Si
N+(CH3)3
-
SO3
SO3-
R
+
NH3
EXTRAÇÃO
H
+ CH3
N
N
H+
CH3
O
C OH
O
O
C OH
O
C
C
O
O
N
Benzoilecgonina
-metabólito da
cocaína
Forma
ionizada
OH-
CH3
O
C O
O
C
O
Forma
ionizada
EXTRAÇÃO
(fase sólida)
H
SO3 -
+ CH3
N
O
C OH
O
C
O
EXTRAÇÃO POR HEAD SPACE
DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS
Amostra (urina,
sangue ou saliva)
+ sulfato de sódio
+ PI
seringa
ESTUFA 70°C
30 min
GC
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
1
2
3
4
5
6
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz
(amostra)
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Fibras comercialmente disponíveis:
Fase estacionária e
espessura do filme
Polidimetilsiloxano
(100um)
Polidimetilsiloxano
(30um)
Abreviação
Aplicação geral
PDMS
Polidimetilsiloxano
(7um)
Polidimetilsiloxanodivinilbenzeno (65um)
Poliacrilato (85um)
PDMS
Compostos nãopolares, voláteis
Não-polares,
voláteis e semivoláteis
Não-polares, semi
e não voláteis
Polar
Carboxenopolidimetilsiloxano
(75um, 85um)
Carbowaxdivinilbenzeno (65um,
75um)
PDMS
PDMS-DVB
PA
CAR-PDMS
Polar, uso geral,
voláteis
Voláteis
CW-DVB
Polar, voláteis
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME:
-Dimensões da fibra (comprimento, espessura);
-Tipo de fibra;
-Temperatura de extração;
-Efeito da matriz (presença de sal, pH);
-Velocidade de agitação;
-Tempo de extração.
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do tempo de extração:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da temperatura de extração:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da concentração de sal:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do pH:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
Vantagens da SPME sobre a SPE e
extração líquido-líquido:
-simplicidade
-prático
-rápido
-extração sem utilização de solventes
-pode ser automatizado.
4) Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivação
Objetivo:
-melhorar as condições cromatográficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
-Derivação
Ex. opiáceos
Aumento da volatilidade
(melhora das condições
cromatográficas (GC)
N.CH3
N.CH3
BSTFA
H
H
H
H
70°C 20
min
CH3
HO
O
OH
CH3
Si
CH3
CH3
O
O
O Si CH3
CH3
-Derivação
Ex. benzoilecgonina
Aumento da sensibilidade
para detectores ECD
N
CH3
PFP/PFPA
O
C O H
O
O
C
70°C 20
min
N
CH3
O
C O CH2CF2CF3
O
O
C
MATRIZES BIOLÓGICAS
• URINA
• SANGUE
• AR EXALADO
MATRIZES ALTERNATIVAS:
• SALIVA
• CABELO
• MECÔNIO
• UNHA
• SUOR
URINA
Néfron
URINA
CARACTERÍSTICAS:
• Coleta não invasiva
• Disponibilidade de grandes volumes de
amostra
• Concentração alta
• Facilidade da análise (baixo custo)
• Possibilidade de adulteração da amostra
• Período de detecção: alguns dias
• Detecção de uso eventual
SANGUE
CARACTERÍSTICAS:
•
•
•
•
•
•
Coleta invasiva
Necessidade de profissional treinado
Matriz relativamente complexa
Período de detecção: algumas horas
Correlação com estado clínico
Maior dificuldade de adulteração
SALIVA
SALIVA
CARACTERÍSTICAS:
•
•
•
•
•
•
•
Coleta não-invasiva
Facilidade na coleta
Coleta sob vigilância e em campo aberto
Correlação com concentração sangüínea
Período de detecção: algumas horas
Pouco volume de amostra
Concentração baixa
CABELO
CARACTERÍSTICAS:
• Coleta não-invasiva
• Período de detecção: meses
– Retrospectiva e cronológica
• Detecção: uso intenso
• Disponibilidade: ????
• Adulteração: difícil
• Possibilidade de contaminação
• Baixa concentração
• Matriz complexa -dificuldade na análise
CABELO
1 cm
2 cm
3 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
8 cm
9 cm
10 cm
MECÔNIO
CARACTERÍSTICAS:
•Exposição fetal
•Coleta não-invasiva
•Matriz complexa -dificuldade na análise
•Período de detecção: meses
•Disponibilidade
•Possibilidade de contaminação
UNHA
UNHA
CARACTERÍSTICAS:
•Coleta não-invasiva
•Baixa concentração
•Dificuldade na análise
•Período de detecção: meses
•Uso intenso
•Disponibilidade????
•Adulteração: difícil
•Possibilidade de contaminação
SUOR
CARACTERÍSTICAS:
•
•
•
•
•
•
Coleta não-invasiva
Coleta através de adesivos “patch”
Baixa concentração
Dificuldade na análise
Não existem muitos estudos
Monitorar pacientes em tratamento
Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivação
Objetivo:
-melhorar as condições cromatográficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
-Derivação
Ex. opiáceos
Aumento da volatilidade
(melhora das condições
cromatográficas (GC)
N.CH3
N.CH3
BSTFA
H
H
H
H
70°C 20
min
CH3
HO
O
OH
CH3
Si
CH3
CH3
O
O
O Si CH3
CH3
-Derivação
Ex. benzoilecgonina
Aumento da sensibilidade
para detectores ECD
N
CH3
PFP/PFPA
O
C O H
O
O
C
70°C 20
min
N
CH3
O
C O CH2CF2CF3
O
O
C
Técnicas de extração e detecção em amostras biológicas de acordo com a
estrutura química das moléculas
D
E
R
I
V
A
Ç
Ã
O

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