Immunità innata stutture batteriche 10.03.2014 - e

Report
Il compartimento naturale
dell’immunità innata
Dr. Luigi Lembo Fazio
Sapienza Università di Roma
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin”
Il sistema immunitario: la funzione
Riconosce gli organismi estranei “invasori”
Previene/limita la loro diffusione
Eradica la loro presenza nell’organismo
Ritorna ad uno stato quiescente
instaurando una condizione di
protezione duratura
(memoria immunologica)
Ma non solo….
È un sistema integrato di cellule professionali
che collaborano e comunicano al fine di
mantenere l’omeostasi
• Esistono due fondamentali sistemi di riconoscimento
e di difesa, correlati tra loro: quello dell’immunità
innata, detta anche naturale o nativa, in quanto preesistente all’esposizione agli agenti microbici o alle
macromolecole estranee, e quello dell’immunità
adattativa.
• La combinazione di questi due sistemi fornisce
un’efficiente difesa contro i microrganismi patogeni o
più in generale contro qualsiasi agente che venga
riconosciuto come “non-self”
I due tipi di immunità…un po’ di storia
Immunita’ innata o naturale
pronta risposta (fase precoce)
controllo/
limitazione dell’infezione
Immunita’ adattativa o acquisita
(fase tardiva)
Innata
eradicazione più lenta
dell’infezione
Immunità di lunga durata
APC
Adattativa
Immunità innata
• È un meccanismo di difesa dell’ospite contro le infezioni,
altamente conservato
• Si ritrova in tutti gli organismi pluricellulari (al contrario
dell’immunità adattativa che è presente solo nei vertebrati)
• Prima linea di difesa sempre attiva che può indurre
l’attivazione del compartimento dell’immunità adattativa
• Fornisce protezione verso una grande varietà di patogeni in
quanto manca di specificità
• È in grado di distinguere tra self e non-self
Immunità innata e adattativa
Proprietà
Innata
Adattativa
Recettori
Fissati nel genoma
Non è necessario il riarrangiamento
Codificati in segmenti genici
Il riarrangiamento è necessario
Distribuzione
Non clonale
Tutte le cellule di una classe identica
Clonale
Tutte le cellule di una distinta
classe
Ligandi
Molecole conservate
Singoli elementi di molecole
Discriminazione selfnon self
Perfetta: selezionata durante
l’evoluzione
Imperfetta: selezionata nelle
cellule somatiche dell’individuo
Tempo di azione
Immediata attivazione degli effettori
Ritardata attivazione degli
effettori
Risposta
Molecole co-stimolatorie
Citochine (IL-1b, IL-6)
Chemochine (CXCL-8)
Espansione clonale
Citochine effettrici (IL-4, IFN-g)
L’immunità innata e l’immunità adattativa: similitudini e differenze
• Barriere chimico-fisiche
Innata
Acquisita
Epiteli
Tessuti linfoidi
associate alle mucose
(MALT)
Muco
pH
• Molecole circolanti
Temperatura
Anticorpi nelle
secrezioni
Complemento
Anticorpi
Recettori circolanti
Recettori di membrana
Recettori intracellulari
• Componente cellulare
Fagociti: Macrofagi
Linfociti T e B
cellule dendritiche (DC)
PMN’s, cellule NK
• Mediatori solubili
Citochine
(IL-1, IL-6, TNF-α)
Citochine
(IL-2, IFN-γ)
I meccanismi dell’immunità innata
Immunità
innata
Barriere
Chimico-fisiche
e strutturali
Epiteli
Cellule ciliate
Muco
pH
Cellule
Mediatori
solubili
Molecole
Circolanti e
Recettori
Fagociti
Citochine e
Proteine della fase
acuta
Complemento e
PRRs
Macrofagi
PMN’s
Monociti
Cellule NK
IFN-α IL-1 IL-6
TNF-α
PRRs di membrana
PRRs circolanti
PRRs citosolici
Le strutture batteriche
Rappresentazione schematica delle componenti batteriche: i PAMPs e i fattori di virulenza
PAMPs
Fattori di virulenza
A
LPS
LPS
CpG DNA
B
Tossine
Flagelli
Plasmide
Flage
lli
Sistema di
secrezione
Peptidoglicano /
Lipoproteine
CpG
DNA
Quali le strutture di interesse?
La parete batterica
• Protezione dai danni di tipo osmotico (più
importante)
Il batterio
non
scoppia!!
• Determina e mantiene la forma del batterio
• Protegge dalle offese meccaniche
• Funzione immunitaria
Organizzazione della parete dei batteri Gram+ e
Gram-
Organizzazione della parete dei batteri
Gram-
Organizzazione della parete dei batteri Gram+ e
Gram- [1]
GRAM+
GRAM –
• Spesso peptidoglicano;
anche 40 strati concentrici
40-80% del peso secco
• Sottile peptidoglicano;
pochi strati concentrici (23) 5% del peso secco pochi
legami crociati
• Altri componenti oltre al
peptidoglicano: acidi
teicoici, acidi teicuronici,
proteine, carboidrati
intercalati nel
peptidoglicano
• Altri componenti oltre al
peptidoglicano: organizzati
a formare una struttura
complessa all’esterno della
mureina: la membrana
esterna
Il lipopolisaccaride
(LPS)
L’LPS: un po’ di storia [1]
 Klebs
Postula l’esistenza di una sostanza pirogena in microrganismi da lui indicati
come “Microsporon septicum” responsabili della maggior parte dei decessi dei
militari.
 Panum
Ipotizza l’esistenza di una tossina pirogena, nel materiale in putrefazione,
non volatile, resistente al calore e solubile in acqua.
L’LPS: un po’ di storia [2]
 Richard Pfeiffer (1858–1910)
Lisati di batteri precedentemente uccisi al calore (V. cholerae) erano in grado
di indurre una reazione di shock tossico quando somministrati nel modello
del guinea pig.
Postula l’esistenza di un principio tossico, resistente al calore, che definisce
Endotossina
 William B. Coley (1862–1936)
Trattamento del sarcoma mediante somministrazione Streptococci Gram
positivi e batteri Gram negativi (S. marcescens) vitali o inattivati con il calore.
Tossina di Coley: questo primo tentativo di terapia vaccinale portava a una
completa remissione dei tumori.
L’LPS: generalità
 Endotossine (per distinguerle dalle esotossine)
Molecole anfifiliche stabili al calore (massa di 10 kDa)
Componente essenziale della membrana esterna di batteri Gram-negativi,
commensali e patogeni:
E. coli, S. typhimurium, N. meningitidis, H. influenzae, B. pertussis, P.
aeruginosa, H. pylori, K. pneumoniae, L. pneumophila, C. trachomatis
 Diverse specie del genere Sphingomonas non possiedono LPS ma
glicosfingolipidi (GSL)
L’LPS: la struttura [1]
 Regione lipofilica, il Lipide A
 Regione oligo/polisaccaridica idrofilica legata covalentemente
Porzione oligo/polisaccaridica
Lipide A
 Stabilizzazione delle molecole di LPS mediante il legame con cationi divalenti
 Funzione di barriera impermeabile
(Polimixine, poliamine, peptidi e proteine cationiche, agenti chelanti [EDTA])
L’LPS: la struttura [2]
In E. coli sono presenti circa 3 x 106 molecole di LPS (4,9 mm2 vs 6,7 mm2)
Principale componente della membrana (45 %); il 75 % della superficie
della membrana esterna è occupato dall’LPS
I lipopolisaccaridi tendono a formare aggregati
L’architettura strutturale dell’LPS è molto conservata e comparabile
nell’ambito delle Enterobacteriaceae (Salmonella spp., E. coli, Shigella)
 In questo modulo comune si ritrovano varianti strutturali:
1. Diversità nella composizione chimica della regione
polisaccaridica
2. Diversità nella struttura del Lipide A
Lipide A: struttura delle Enterobacteriaceae
Legame
estere
Scheletro di D-glucosamine
• lo scheletro è costituito
da un disaccaride con
legame b,1-6
Legame
a-glicosidico
Posizione di attacco della regione polisaccaridica
• sono presenti due
gruppi fosforici
(solitamente il Lipide A è
monofosforilato)
• sono presenti fino a 4
catene aciliche che a loro
volta possono essere
sostituite da ulteriori
acidi grassi  fino a 7
sostituenti acidi
Lipide A: il caso di E. coli
Il lipide A di E. coli viene generalmente riportato come esa-acilato; in
quantità più o meno variabili anche le specie penta e tetracilate.
 Gli acidi grassi principali hanno un numero di atomi di carbonio compresi
tra C10 e C16
C18 e C21 in H. pylori e C. trachomatis
 Il numero di catene aciliche varia considerevolmente e ha un effetto diretto
sulla tossicità dell’LPS
 Gli acidi grassi idrossilati sono legati allo scheletro glucidico mediante
legami esterici o amidici in posizione 2 e 2’ e 3 e 3’
K12
Lipide A: variazioni nei gruppi fosforici
N. meningitidis LipideA
Fosfatidil-etanolamina
Le principali sostituzioni presenti nel Lipide A dei Gram-negativi sono:
1. Gruppi pirofosforici (PP),
2. etilamina, etanolamina, difosfoetanolamina
3. Residui saccaridici: L-arabinosio; L,D-glicero-D-manno-eptosio; acido Dgalatturonico
Lipide A: variazioni del pattern di acilazione
Le principali variazioni
Legame
estere
Scheletro di D-glucosamine
riguardano:
1. Il numero delle catene di
acidi grassi
2. La posizione relativa delle
catene di acidi grassi
3. La natura dei gruppi acilici
- acido miristico
- acido palmitico
- acido stearico
- acido laurico
Legame
a-glicosidico
Lipide A: variazioni nei gruppi fosforici e
nel pattern di acilazione
Acido galatturonico
b-idrossibutirrato
al C28
La regione del “Core”[1]
1.
Sulla
base
della
(monosaccaridi)
composizione
nelle
in
zuccheri
Enterobacteriaceae
si
distinguono:
CORE ESTERNO
CORE INTERNO
2. Core esterno: consiste prevalentemente di ESOSI (D-glucosio, D-galattosio, Dglucosamina, N-acetilglucosamina, N-acetilgalattosamina)
Il numero delle unità può variare da 8 a 12
3. Core interno: presenza di un caratteristico monosaccaride, il Kdo (acido 3deossi-D-manno-octolusonico)
Gli eptosi del core interno possono essere sostituiti con gruppi fosforici,
pirofosforici, e fosforiletanolamina (Salmonella spp., Shigella, E. coli)
La regione del “Core” [2]
Alcune eccezioni
- Francisella tularensis
Manca completamente degli eptosi del core esterno; il solo residuo di Kdo
presente è legato a un disaccaride di mannosio [b-mannosio (1–4) –a mannosio]
- Legionella pneumophila
Come per F. tularensis non vi sono eptosi ma residui di mannosio
….e ancora Acinetobacter, Chlamydia, Moraxella, Rhizobium
La regione minima dell’LPS richiesta in E. coli è costituita
dal lipide A e da due unità di Kdo
La regione del “Core” [3]
Alcune eccezioni
Alcune specie batteriche, Acinetobacter haemolyticus, B. cepacia, Y. Pestis,
incorporano analoghi del Kdo, l’acido D-glicero-D-talo-octulosonico (Ko).
La presenza del Kdo e dei residui di eptosio è stata (e tuttora è in uso)
considerata un marker di identificazione dell’LPS. Nella clinica rappresenta
un importante marker diagnostico per il rilevamento delle infezioni da parte
di batteri Gram negativi.
Patogeni non enterici, quali N. meningiditis, mancano dei residui di eptosio
e incorporano il Ko in sostituzione del Kdo.
La regione del “Core” [4]
Eterogeneità della composizione del core
Il grado di diversità osservato nella regione del core dell’LPS dipende in
buona parte da due fattori:
1. Presenza di sostituenti in rapporto non stechiometrico
2. Meccanismi genetici, primo fra tutti la variazione di fase
Variazione di fase: scivolamento della polimerasi, durante il processo
della replicazione in piccole sequenze nucleotidiche ripetute,
all’interno di geni codificanti gli enzimi del macchinario biosintetico
dell’LPS.
 H. influenzae, Neisseria spp., Campylobacter
In N. meningiditis aggiunta di gruppi di acido sialico che correla con una più
spiccata invasività e persistenza nei tessuti dell’ospite.
L’antigene somatico o Antigene-O [1]
1. L’antigene somatico è la regione dell’LPS che entra a
diretto contatto con le membrane dell’ospite
2. Regione fortemente antigenica; la caratterizzazione
della composizione in zuccheri rappresenta la base
per una classificazione
sierologica dei diversi
sierotipi
3. Rappresenta una sorta di fingerprint del batterio.
4. Queste catene saccaridiche aiutano il batterio a sfuggire all’azione litica da
parte delle molecole del complemento, in un processo che viene definito
“shielding”.
5. Proteggono la cellula batterica dall’azione di numerosi antibiotici
6. Possono funzionare anche come
(Acinetobacillus pleuropneumoniae).
importanti
sistemi
di
adesione
L’antigene somatico o Antigene-O [2]
 50 unità oligosaccaridiche ripetute costituite da 2-8
monosaccaridi variabili
 Si conoscono almeno 20 residui saccaridici che possono
entrare nella composizione dell’O-chain, molti dei quali
presentano caratteristiche uniche (dideossi-esosi): colitosio,
paratosio…
 alcuni sierotipi di E. coli (O8 e O9), di K. pneumoniae (O3 e
O5) e L. pneumophila contengono omopolimeri (mannosio)
 Estrema variabilità nella composizione anche all’interno della stessa specie
 La sintesi dell’antigene-O è determinata dal cluster genico wb (rfb)
 Mutanti difettivi nel cluster wb o mutanti di delezione Dwb presentano una morfologia
diversa:
R-mutants (R: rought)
batteri wild-type: S (S: smooth)
L’antigene somatico o Antigene-O [3]
1.
I mutanti R sono in grado di crescere in
brodocoltura
2.
La porzione dell’antigene-O è dispensabile per
la crescita batterica
 Nel caso delle specie patogene (Salmonella, Shigella, E. coli EPEC) la mancanza
della regione somatica rende i batteri più suscettibile alla fagocitosi e all’attacco
delle proteine del complemento.
 Patogeni batterici come N. meningitidis, H. influenzae, B. pertussis, H.
influenzae, e C. trachomatis mancano dell’antigene-O
molecolare o lipooligosaccaridi [LOS])
(LPS a basso peso
L’antigene somatico o Antigene-O [4]
 Lo scheletro dell’antigene somatico può presentarsi in
forma lineare o ramificata, dipendente dalla presenza di
gruppi sostituenti.
I più comuni sostituenti sono: gruppi fosfato e fosforiletanolammina; gruppi acetili. Meno frequenti: gruppi formilici,
e acido glicerico.
Durante il pathway biosisntetico le singole unità saccaridiche vengono polimerizzate in
blocchi e aggiunte alla regione del core.
 Le molecole di LPS sono dunque formate da catene saccaridiche di diverse lunghezza
(elettrofresi SDS).
Funzioni dell’LPS
 Nel caso delle specie patogene (Salmonella, Shigella, E. coli EPEC) l’LPS è
fondamentale per l’interazione ospite-patogeno
 Difesa dall’attacco del complemento: a seconda della lunghezza delle catene
polisaccaridiche l’LPS può inibire la formazione del MAC e quindi la lisi batterica
 Consente una maggiore protezione dal processo di fagocitosi
 Mimetismo molecolare:
H. pylori (composizione dell’LPS che ricalca gli acidi di Lewis)
Campilobacter jejuni (simile ai gangliosidi delle cellule eucariotiche); disordini
autoimmunitari neurodegenerativi, sindrome di Guillan Barré
Neisseria meningiditis aggiunta di residui di acido sialico ai LOS con conseguente
inattivazione del complemento
La diversa struttura tridimensionale influenza
il potenziale immunogenico
Struttura conica
struttura cilindrica
Agonista TLR4
Antagonista TLR4
Lipide A: struttura delle Enterobacteriaceae
Legame
estere
Scheletro di D-glucosamine
• lo scheletro è costituito
da un disaccaride con
legame b,1-6
Legame
a-glicosidico
Posizione di attacco della regione polisaccaridica
• sono presenti due
gruppi fosforici
(solitamente il Lipide A è
monofosforilato)
• sono presenti fino a 4
catene aciliche che a loro
volta possono essere
sostituite da ulteriori
acidi grassi  fino a 7
sostituenti acidi
Francisella tularensis
 F. tularensis è un cocco bacillo Gram negativo, non mobile, aerobio
Agente eziologico della tularemia: infezione/infiammazione della vie aeree che può
evolvere verso broncopolmoniti.
 Patogeno umano e animale.
 La trasmissione avviene attraverso il morso degli artropodi, il contatto con tessuti
animali infetti, via aerosol, acqua e cibo contaminati.
 Diffusione dei batteri a livello dei linfonodi e disseminazione
per via ematica ai polmoni, pleura, milza, fegato e reni.
Modificazioni del Lipide A: il caso di Francisella tularensis [1]
 F. tularensis sintetizza quantità relativamente scarse di LPS
 l’LPS di F. tularensis contiene quantità notevoli di lipide A libero
1. Mancanza del Kdo
2. Mancanza di molte specie di zuccheri nella regione del core interno
 Quale sia il significato biologico delle modificazioni del lipide A di F. tularensis non è
noto. Nel genoma sono infatti presenti tutti gli enzimi per la biosintesi del Kdo e per
l’aggiunta degli zuccheri del core.
 Possibile esistenza di un’idrolasi di membrana ?
Modificazioni del Lipide A: il caso di Francisella tularensis [2]
Modificazioni del Lipide A: il caso di Francisella tularensis [3]
 Quali sono le reazioni enzimatiche responsabili di queste modifiche del lipide A?
Presenza di due specifiche fosfatasi di membrana:
1. LpxE
2. LpxF
Ceppi di F. novocida che mancano della fosfatasi LpxF mostrano un fenotipo attenuato
nei modelli murini di infezione. Maggiore suscettibilità a peptidi cationici
antimicrobici
Presenza di una trasferasi:
3. ArnT (PmrK)
In F. tularensis catalizza l’aggiunta del residuo di galattosamina al gruppo fosfato C1.
Lo stesso enzima funziona anche nel pathway biosintetico dell’LPS delle
Enterobacteriaceae.
Ceppi di Salmonella che esprimono la fosfatasi LpxE presentano un Lipide A
monofosforilato (monofosforil Lipide A). Importanti nell’ambito clinico come
adiuvanti vaccinali e per lo sviluppo di vaccini orali.
Modificazioni del Lipide A: il caso delle Enterobacteriaceae [1]
Legame
estere
Scheletro di D-glucosamine
Legame
a-glicosidico
Modificazioni del Lipide A: il caso delle Enterobacteriaceae [2]
 E coli K12 e S. typhimurium codificano numerosi enzimi responsabili delle
modificazioni del Lipide A
Ma quali sono queste modifiche?
1. Sostituzione dei gruppi fosfato al C1 e al C4’ con gruppi fosfoetanolamminici
2. Sostituzione e aggiunta al C4’ di un residuo di 4 ammino-arabinosio (L-Ara4N)
3. Modifiche nelle catene aciliche primarie, incorporazione di palmitato
4. Idrossilazione delle catene aciliche primarie
5. Modifiche delle catene aciliche secondarie
Molte delle modifiche osservate nella composizione chimica del lipide A rispondono a
cambiamenti delle condizioni di crescita
Modificazioni del Lipide A: il caso delle Enterobacteriaceae [3]
C14 acido miristico
C16 acido palmitico
Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [1]
 Il sistema meglio conosciuto è quello PagP/PagL
PagP: Lipide A palmitoleil transferasi
PagL: Lipide A deacilasi (lipasi della membrana esterna)
Il sistema PagP/PagL permette la rimozione della catena acilica di idrossimiristato (PagL)
dal C3e conseguentemente l’aggiunta di palmitato (PagP)
Le modificazioni del pattern di acilazione rispondono al sistema a due componenti
PhoP/PhoQ
PagL
3-O-deacilasi
Mutanti di S. typhimurium incapaci di aggiungere palmitato al Lipide A diventano più suscettibili all’azione di alcuni
peptidi cationici con attività antibatterica ma non alle polimixine.
Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [2]
sistemi di percezione sensoriale a due componenti
 Caratterizazione in seguito
PERIPLASMA
all’individuazione di mutazioni pleiotropiche
NH-2
in E. coli, Salmonella.
 Due componenti:
1. Sensore (proteina di membrana)
COOH
2. Regolatore di risposta (citosolico)
CITOPLASMA
COOH
NH-2
Sensore: dominio sensoriale e un
dominio del trasmettitore
Regolatore: Dominio di ricezione e un
dominio di legame al DNA
Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [3]
Il sistema PhoP/PhoQ
PhoP: attivatore/repressore trascrizionale
PhoQ: protein chinasi
Il complesso PhoP/PhoQ può regolare (attivare o reprimere) simultaneamente più di 40
geni differenti
Fattore
ambientale
Informazione
di tipo
trascrizionale
al genoma
Percezione del
segnale
In particolare:
Basse
concentrazioni
di Mg++
Attivazione del
sistema
PhoP/PhoQ
Modificazioni
strutturali del
Lipide A
Idrossilazione in
posizione 2 dell’acido
miristico
Attivazione del
sistema PagP/PagL
Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [4]
Il sistema PhoP/PhoQ
Il sistema PmrA/PmrB
Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [4]
Il sistema PhoP/PhoQ
Il sistema PmrA/PmrB
Modificazioni del Lipide A: il caso delle Enterobacteriaceae [3]
C14 acido miristico
C16 acido palmitico
Modificazioni del Lipide A: il caso delle Enterobacteriaceae [4]
1. Aggiunta dell’L-Ara4N
Il residuo di L-Ara4N è caricato positivamente e neutralizza la carica negativa dei gruppi
fosforici presenti al C1. Questa modifica del Lipide A riduce la sensibilità dei batteri a
diverse classi di peptidi cationici ad attività antibatterica (defensine e catelecidine) e
alle polimixine.
2. Aggiunta di due gruppi fosfoetanolammina
Due sono gli enzimi coivolti in questo tipo di modifica del Lipide A: EptA e EptB. EptA
catalizza l’aggiunta della fosfoetanolammina prevalentemente al C1. In particolari
condizioni di crescita o in condizioni limitanti di arabinosio la modifica del gruppo
fosforico può interessare anche il C4’. Ancora non si conosce il motivo di questi
cambiamenti.
Il sistema PagP/PagL
 L. pneumophila e B. bronchiseptica
PagP è essenziale per l’infezione degli animali. L’aggiunta di palmitato promuove la
resistenza ai peptidi antimicrobici e alla lisi del complemento mediata da anticorpi.
 Y. pseudotubercolosis
L’incorporazione di palmitato avviene in misura maggiore in risposta a variazioni della
temperatura (all’interno dell’ospite)
 P. aeruginosa
Modificazioni del lipide A oltre che per aggiunta di palmitato (PagP/PagL) anche per
aggiunta di idrossi-laurato e amino-arabinosio
Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [4]
 LpxR: lipasi della membrana esterna (deacilasi); è sotto il controllo del sistema
PhoP/PhoQ
LpxO: enzima della membrana interna che idrossila le catene aciliche secondarie
Gli enzimi LpxR, LpxO e PagL non sono
presenti in E. coli K12. Quando
sovrespressi in E. coli K12 determinano
le tipiche modifiche del Lipide A
osservate in Salmonella.
Modificazioni dell’antigene-O [1]
 50 unità oligosaccaridiche ripetute costituite da 2-8
monosaccaridi variabili
 Si conoscono almeno 20 residui saccaridici che possono
entrare nella composizione dell’O-chain, molti dei quali
presentano caratteristiche uniche (dideossi-esosi): colitosio,
paratosio.
 Molecole eteropolimeriche (o omopolimeriche)
 La regione dell’antigene-O dell’LPS è quella sottoposta a maggiori modificazioni
- Salmonella: 1000 varianti chimicamente e strutturalmente diverse
- E coli: esistenza di 173 diverse molecole di antigene-O
 Le molecole di LPS estratte da una singola popolazione batterica sono spesso eterogenee
nella struttura: esistenza di un ampio spettro di glicoforme.
 Le alterazioni nella struttura dell’LPS avvengono in risposta a variazioni delle condizioni
ambientali e nel caso dei patogeni in risposta non solo all’ambiente dell’ospite ma anche ai
diversi step della patogenesi.
Modificazioni dell’antigene-O [2]
Che cosa intendiamo per variazioni dell’antigene-O e a che livello si realizzano?
1. La composizione chimica dell’antigene-O
La composizione in zuccheri: il tipo e il numero di monosaccaridi che entrano nella
composizione
2. La struttura dell’antigene-O
-
Diversità nel tipo di legame glicosidico (cambiamento posizionale e anomerico)
Configurazione degli zuccheri
Presenza di gruppi sostituenti
Lunghezza delle catene dell’antigene-O
Modificazioni dell’antigene-O [3]
1. Quali sono le principali variazioni in termini di gruppi sostituenti?
1. Gruppi saccaridici: fucosilazione e glicosilazione
2. Gruppi non saccaridici: metilici e acetilici
Generalmente le variazioni non avvengono in maniera stechiometrica!
2. Quali sono i meccanismi attraverso i quali i batteri modificano l’antigene-O?
1. Riprogrammazione dell’espressione genica
2. Conversione lisogenica (mediata da fagi)
3. Trasferimento genico orizzontale (HGT) anche noto come trasferimento genico
laterale (LGT) seguito da eventi di ricombinazione
Modificazioni dell’antigene-O [4]
I meccanismi del trasferimento genico orizzontale (HGT)


Comparazione delle sequenze geniche che codificano
dell’antigene-O
Microrganismi modello: S. enterica e E. coli
Cromosoma
Gene A
Gene B
Gene C
Gene D
gli enzimi del pathway biosintetico
Gene E
Gene F
Cromosoma
Regione variabile
Regione costante
Regione costante
 Organizzazione in cluster
 Il numero dei geni varia da un minimo di 6 unità fino anche a 9 per ciascun cluster (complessità
della catena dell’antigene-O)
 Contenuto in G+C diverso rispetto agli altri geni cromosomiali (generalmente inferiore al 40%)
 All’interno del cluster il contenuto in G+C dei geni è diverso
 Assemblaggio dei geni in un cluster (come i tasselli di un puzzle)
 Presenza di regioni più o meno conservate e di regioni variabili che possono favorire eventi di
excisione e di ricombinazione
 Acquisizione del materiale genetico attraverso plasmidi

Ci sono batteri, H. pylori, nei quali i geni del pathway biosisntetico dell’antigene-O non sono
organizzati in cluster ma interspersi nel genoma
Modificazioni dell’antigene-O [5]
La conversione lisogenica
 Un altro modo che i batteri sfruttano per acquisire nuovo materiale genetico è il processo della
trasduzione, mediata dai fagi.
 Alcune proteine che vengono espresse dal fago, durante il suo ciclo lisogenico, entrano a far parte
della parete cellulare batterica. In alcuni casi queste nuove proteine possono conferire fenotipi di
virulenza
1. Geni lom del fago l che codificano per fattori di adesione di alcuni ceppi di E. coli alle cellule
dell’epitelio orale)
2. Geni bor conferiscono una più spiccata resistenza degli E. coli nel siero
 L’integrazione di un fago nel genoma batterico può portare alla conversione sierotipica
Conversione sierotipica
Aggiunta di gruppi glucosidici o O-acetilici sugli zuccheri dell’antigene-O grazie ad enzimi
espressi specificatamente dal pro-fago con conseguente shift di un batterio da un sierotipo a
un altro.
Quello della conversione sierotipica è un meccanismo di protezione del pro-fago.
La conversione lisogenica: il caso di Shigella [1]
Agente eziologico
Shigella spp.
S. flexneri, S. boydii, S. sonnei,
S. dysenteriae
50 seriotipi
Sintomi
Febbre, crampi addominali
Sangue e muco nelle feci
Sito d’infezione
Epitelio del colon e del retto
Trasmissione/Dose infettiva
Acqua e cibo contaminati
10 – 100 batteri
Dati epidemiologici
170 milioni di casi l’anno
1 milione di morti prevalentemente
nei Paesi in via di sviluppo
La conversione lisogenica: il caso di Shigella [2]
La glicosilazione
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In S. flexneri l’antigene-O è una catena tetrasaccaridica
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Il batteriofago X di S. flexneri (SfX) permette la conversione del sierotipo Y al sierotipo X
Aggiunta di un residuo di glucosio al primo residuo di ramnosio
Serotype X
La conversione lisogenica: il caso di Shigella [3]
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Il batteriofago X di S. flexneri (SfX) permette la conversione del sierotipo Y al sierotipo X
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Aggiunta di un residuo di glucosio al primo residuo di ramnosio
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Sono note le proteine del batteriofago che intervengono nella modifica dell’antigene-O
GtrX: glicosil trasferasi
GtrA: piccola proteina altamente idrofobica responsabile del trasferimento del residuo di
glucosio legato ad un lipide carrier attraverso la membrana
GtrB: enzima che catalizza il trasferimento del residuo di glucosio dall’UDP-glucosio al
lipide carrier
Le modificazioni dell’antigene–O in seguito all’aggiunta di residui di glucosio possono interessare
anche gli altri residui di ramnosio e anche l’GlcNac. Questo dipende dalla natura del batteriofago. Il
risultato è l’insorgenza di nuovi sierotipi.
Modificazioni dell’antigene-O [6]
Riprogrammazione dell’espressione genica
 L’espressione dei geni che regolano le modificazioni dell’antigene-O può essere regolata in
risposta a variazioni dell’ambiente (temperatura, disponibilità di nutrienti, pH)
 Nel caso dei patogeni questi meccanismi possono operare in risposta anche ai diversi step della
patogenesi.
Possiamo riconoscere due diversi meccanismi:
1. Attivazione/Repressione finemente regolata in risposta agli stimoli esterni ( es. sistema
sensoriale a due componenti)
2. Un meccanismo random di accensione e spegnimento di specifici geni: variazione di
fase, anche nota come variazione antigenica
 La variazione di fase è un meccanismo che avviene spontaneamente, con un’elevata frequenza
(0,5%). È un meccanismo switching on/of reversibile
Il flagello in Salmonella
Le fimbrie di tipi I e i pili Pap di E. coli
i LOS di H. influenzae e N. meningiditis
le proteine Opa di N. gonorrheae
Quattro sono i principali cambiamenti nella struttura dell’antigene-O dovuti a eventi di variazione di
fase: fucosilazione, glicosilazione, acetilazione e cambiamenti della lunghezza della catena
saccaridica

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