Universidade Federal do Amazonas

Report
Avaliação da citotoxicidade e da genotoxicidade de uma
naftoquinona furano sintetizada a partir de 2-hidroxi-1,4naftoquinona (Lawsona)
SOUSA, Leilane Bentes; RIBEIRO, Gilderlany Gomes de Souza; CARDOSO, Mariana Filomena do
Carmo; SILVA, Fernando de Carvalho da; FERREIRA, Vitor Francisco; VASCONCELLOS, Marne
Carvalho de. Universidade Federal do Amazonas – UFAM.
PIBIC 2013/2014 – UFAM
Oncologia experimental e
toxicologia clínica
Manaus - AM
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Introdução
 Naftoquinonas
• Derivadas do naftaleno
Figura 1: Estrutura química da 1,2-naftoquinona (A) e 1,4-naftoquinona (B).
• Família das quinonas
• Dois grupos carbonílicos nas posições 1,2 ou 1,4 do anel
naftaleno
• Extrato da folha Lawsonia inermis ->
Cosmético e tratamento de micoses
Antifúngica
Antitumoral
Antibacteriana
Antiviral
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Introdução
IVS 320
• Naftoquinona furano
• Derivada da Lawsona
• Antifúngico contra Cryptococcus
spp. e diferentes espécies de
Candida
IVS320 - 1H-ciclopenta[b]nafto[2,3d]furano-5,10(3aH,10bH)-diona
Antitumoral ??
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Objetivo
Avaliar o potencial citotóxico e genotóxico da IVS320
(1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano5,10(3aH,10bH)-diona) na linhagem de fibroblastos
humano não-tumoral (MRC5).
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Metodologia
Obtenção da amostra:
Amostra:
Obtida sinteticamente a partir de 2-hidroxi-1,4-naftoquinona
(Lawsona – C10H6O3) e cedida pelo Prof. Vitor Francisco Ferreira da
Universidade Federal Fluminense
.
IVS320 - 1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano-5,10(3aH,10bH)-diona
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Metodologia
Cultura de células
Linhagem:
Fibroblasto Humano não-tumoral
(MRC5);
Fonte: Arquivo pessoal
Cultura celular:
Meio de cultura Dulbeco’s Modified Eagle
Medium (DMEM), contendo 10% de Soro
Fetal Bovino (SFB) e 1% de antibiótico
Penicilina/Estreptomicina.
As células foram mantidas em estufa a 5% de CO2 e 37oC.
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Metodologia
Obtenção da amostra
Cultura de células
Controle positivo:
DOXORRUBICINA
Controle negativo:
DMSO
IVS320
Plaqueamento e tratamento
Avaliação da Citotoxicidade
-Placas de 96 poços
- 0,5 x 104 cél/poço
- Curva 0,3125uM a 20uM
Alamar Blue
(Ahmed et al, 1994)
- CI50
Avaliação da Genotoxicidade
-Placas de 24 poços
- 20 x 104 cél/poço
- 1μM; 2,5 μM e 5 μM
Teste do Cometa
- pH Alcalino
- pH Neutro
- ID e FD
(Singh et al, 1988)
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Resultados e discussão
 Citotoxicidade
CI50 (µM)
Substância
24 h
48 h
72 h
IVS320
3,83 (3,24 – 4,52)
c – 4,18)
3,44 (3,13 – 3,77) 3,76 (3,38
Doxorrubicina
3,90 (3,15 – 4,83)
0,43 (0,37 – 0,50) 0,34 (0,27 – 0,43)
Tabela 1: Efeito da IVS320 sobre a linhagem de fibroblasto humano não - neoplásico (MRC5) nos tempos de
tratamento de 24, 48 e 72h. Os valores estão representados como CI50 (intervalo de confiança de 95%).
Doxorrubicina foi utilizada como controle positivo.
• A IVS320 foi capaz de ser menos tóxica que a doxorrubicina
em 48 e 72h de tratamento;
• FREIRE et al (2010)
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Resultados e discussão
 Genotoxicidade –Índice de Dano Total
A
B
Gráfico 1- Índice de dano ao DNA em células MRC-5, após 3h de tratamento com a IVS320. A- Cometa alcalino; BCometa neutro. * p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado ao DMSO (0,2%) por
ANOVA seguido de teste Tukey.
• Cometa Alcalino: A IVS320 apresentou aumento significativo no ID nas
concentrações de 2,5 e 5,0 µM comparado ao DMSO e DOX.
• Cometa Neutro: A IVS320 apresentou diminuição significativa no ID em
todas as concentrações testadas comparado a DMSO e DOX.
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Resultados e discussão
 Genotoxicidade – Frequência de dano
A
B
N e u tr o
A lc a lin o
100
100
F re q u ê n c ia d e D a n o
dox
80
1 ,0
60
2 .5
5 ,0
40
20
F r e q u ê n c ia d e D a n o
DMSO
DMSO
D ox
80
1 ,0
60
2 ,5
5 ,0
40
20
0
0
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
Gráfico 2- Frequência de dano ao DNA em células MRC-5, após 3h de tratamento com a IVS320. A- Cometa alcalino; B- Cometa neutro.
Doxorrubicina
IVS320 (2,5 µM)
Alcalino: Graus 1 e 2
Alcalino: Grau 3
Neutro: Graus 3 e 4
Neutro: Grau 1
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Conclusão
 Baixa citotoxicidade em linhagem de fibroblasto não-neoplásico
comparada a Doxorrubicina após 48 e 72h de tratamento;
 Apresentou genotoxicidade em todas as concentrações testadas, em
menor intensidade que a Doxorrucinica no ensaio do cometa em pH
neutro (quebra de fitas duplas);
 Ensaios complementares são necessários para comprovar sua
segurança e verificar se o tipo de dano causado ao DNA das células
é reversível ou não.
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Agradecimentos
 À Deus e minha família
 Profa. Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos
 Mariana Filomena do Carmo Cardoso
 Prof. Dr. Fernando de Carvalho da Silva
 Prof. Dr. Vitor Francisco Ferreira
 Gilderlany Gomes de Souza Ribeiro
À Faculdade de Ciências
Farmacêuticas e à todos que
contribuíram diretamente para
a realização desta pesquisa.
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Referências Bibliográficas
AHMED, S. A.; GOGAL, R. M.; WALSH, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to
monitor and determine the proliferation of lymphocytes an alternative to [3H] thymidine
incorporation assay. Journal of immunological methods, v. 170, n. 2, p. 211-224, 1994.
FERREIRA, M. P. S.; CARDOSO, M. F. C.; SILVA, F. C.; FERREIRA, V. F.; LIMA, E. S.; SOUZA, J. V. B.
Antifungal activity of synthetic naphthoquinones against dermatophytes and opportunistic
fungi: preliminary mechanism-of-action tests. Ann Clin Microbiol Antimicrob, v. 13, n. 26,
2014.
FREIRE, C. P. V. et al. Synthesis and biological evaluation of substituted a- and b-2,3dihydrofuran naphthoquinones as potent anticandidal agents. Med. Chem. Commun., v. 1, p.
229-232. 2010.
SINGH, N. P.; MCCOY, M. T.; TICE, R. R.; SCHNEIDER, E. L. A simple technique for quantitation
of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research, Volume 175,
Issue 1, pp. 184-191, 1988.
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