2.2.5.5 Priemyselny vyskum novych lieciv na baze rekombinantnych

Report
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Priemyselný výskum nových liečiv
na báze rekombinantných proteínov
ITMS: 26240220034
Týždeň vedy a techniky
5. - 11. novembra 2012
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
o Druh projektu:
partnerský projekt v rámci „Podpora aplikovaného výskumu,
vývoja a transferu technológií“
o Žiadateľ projektu:
hameln rds, Modra
o Zodpovedný riešiteľ projektu za partnera a názov
príslušnej fakulty:
doc. RNDr. Stanislav Stuchlík, CSc.
Prírodovedecká fakulta UK
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Hlavný zámer/ciele projektu:
o Založenie a manažment spoločného výskumného
pracoviska a maximalizácia spoločenskej pridanej hodnoty
projektu.
o Zavedenie produkčných a analytických metód pre výskum
nových liečiv na báze rekombinantných proteínov.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Stručná anotácia projektu:
o Realizácia špičkového priemyselného výskumu na koordinovanom
projektovom princípe, pričom implementácia predkladaného projektu
predpokladá, že nová infraštruktúra obstaraná v rámci projektu umožní
zvýšiť participáciu na nových projektových aktivitách financovaných
z iných finančných zdrojov a celkovo tieto aktivity zvýšia hospodársku
efektívnosť a úspešnosť žiadateľa v jeho komerčných aktivitách
založených na výsledkoch priemyselného výskumu.
o Realizácia tohto projektu umožní žiadateľovi v úzkom prepojení na
pracovisko partnera realizovať vývoj nových liečiv, čím sa zvýši ponuka
služieb a vzrastie jeho schopnosť konkurencie. Tiež budú vyvíjané nové
inovatívne topické aplikačné formy na báze ľudských rekombinantných
proteínov (ako napr. trombín).
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Spôsob riešenia projektu:
o konštrukcia rekombinantného kmeňa a definovanie podmienok
jeho dlhodobého uchovávania, návrh postupov pre kultiváciu
produkčného kmeňa a produkciu rekombinantných proteínov
o optimalizácia expresie a postup izolácie rekombinantného
proteínu
o vývoj purifikačných a analytických metód (1D a 2D SDS PAGE
Elektroforéza, elektroforetické čipy, FPLC, HPLC – reverzná fáza,
Western blot, Izoelektrická fokusácia)
o optimalizácia vlastností a stabilizácia rekombinantných proteínov
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
o V rámci aktivity 1.1 prebehlo vypracovanie a podpis zmluvy a štatútu
spoločného pracoviska a vypracovanie podkladov pre definovanie
dlhodobého strategického plánu spoločného pracoviska. Vykonalo sa verejné
obstarávanie prístrojov a spotrebného materiálu.
o V rámci aktivity 1.2 prebehla študentská vedecká konferencia s posterovou
prezentáciou dosiahnutých výsledkov, ktorej výsledkom je príspevok
v zborníku. V rámci diplomových a dizertačných prác boli identifikované
základné témy pre výskum mladých vedeckých pracovníkov vo väzbe na
interné tematické priority spoločného pracoviska.
o V rámci aktivity 2.1 sa vzhľadom na možnosti využitia spotrebného
materiálu zakúpeného z projektových zdrojov zintenzívnili činnosti súvisiace
s prípravou „konštrukcie rekombinantného kmeňa producenta proteínu“.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Produkcia ľudského rekombinantného trombínu
v expresnom systéme E. coli
Trombín - multifunkčná serínová proteáza,
Využitie vo farmaceutickom priemysle –
vďaka svojim vlastnostiam
a dôležitej úlohe pri tvorbe krvnej zrazeniny ako lokálne hemostatikum
Najideálnejšiou prípravou trombínu, ktorý by spĺňal vysoké kritéria na to, aby
mohol byť využitý ako súčasť farmaceutických prípravkov, je príprava
rekombinantného trombínu využitím techník rekombinantných DNA
Návrh
a
dizajn
expresného
systému
na produkciu ľudského
rekombinantného trombínu v baktérii E. coli a optimalizáciu podmienok
heterologickej expresie najkratšieho prekurzora trombínu, pretrombínu-2 (PT2), v expresnom systéme E. coli.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Produkcia ľudského rekombinantného trombínu
v expresnom systéme E. coli
SDS-PAGE profil expresie proteínov
v E. coli K12 RV308ai pJK100-PT2
po indukcii expresie PT-2 (36kDa)
s 0,0005 % arabinózou pri OD600
úroveň expresie
po 5h bola 45%
Dráhy 1-6: 0-5h po indukcii;
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
Rekombinantný PT-2 sa v
bunkách E. coli produkuje vo
forme inklúznych teliesok,
preto je nevyhnutná izolácia
inklúznych teliesok a následný
refolding PT-2 a následná
aktivácia
rekombinantného
pretrombínu-2
na
aktívny
trombín.
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Príprava rekombinantného ekarinu
v produkčnom kmeni Pichia pastoris
Ekarin - metaloproteáza hadieho jedu Echis carinatus, s prokoagulačným
účinkom
- uplatnenie vo farmaceutickom priemysle
- špecifická proteáza na aktiváciu rekombinantného prekurzora trombínu.
Izolácia ekarinu z hadieho jedu je však finančne náročná a spojená s potenciálnym
rizikom kontaminácie produktu nedostatočnou purifikáciou, čo značne obmedzuje
jeho aplikáciu v klinickej praxi.
Heterologická produkcia ekarinu bola zatiaľ realizovaná iba v bunkových líniách
vyšších eukaryotov. Úspešná produkcia v Pichia pastoris by nielen rozšírila rady
hostiteľov, v ktorých sa ekarin rekombinantne produkuje, ale aj prispela k väčšej
dostupnosti tejto proteázy.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Príprava rekombinantného ekarinu
v produkčnom kmeni Pichia pastoris
Optimalizácia a syntéza sekvencie cDNA kódujúcej ekarin poddruhu Echis
carinatus leucogaster s integrovanými štiepnymi miestami a histidínovou
kotvou.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Príprava rekombinantného ekarinu
v produkčnom kmeni Pichia pastoris
inaktívny
ekarin
Protrombín
intermediát
aktívny
ekarin
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
Trombín
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Štúdium promótorovej sekvencie
α-glukozidázového génu kvasinky Candida utilis
Candida utilis vzhľadom na nízke nároky na kultiváciu a zaradenie do kategórie GRAS
(Generally Recognize As Safe) predstavuje potenciálne významný expresný systém pre
nadprodukciu rekombinantných proteínov vhodných aj pre medicínske/farmaceutické
aplikácie.
Heterologická expresia proteínov v kvasinkových expresných systémoch je založená na
presnej charakterizácii silných promótorov.
Mapovanie promótorovej sekvencie α-glukozidázového génu C. utilis pomocou
integračného vektora.
Dizajn a konštrukcia integračného plazmidu pPICZα-glc, transformácia divého kmeňa
C. utilis a detekcia inzercie vektora.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Štúdium promótorovej sekvencie
α-glukozidázového génu kvasinky Candida utilis
Konštrukcia mutačnej kazety na deléciu promótora α-glukozidázového génu C. utilis
Klonovanie mutačnej kazety do vektora pUC19 cez HindIII
1. HighRanger 1kb DNA
Ladder (Norgen Biotek)
2. pUC19/HindIII (2,7 kb)
3. pUC19+mutačná kazeta/
HindIII (2,7+2,4 kb)
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Štúdium a návrh RP-HPLC metódy s DAD detekciou na robustnú
separáciu proteínov prítomných v komplikovaných zmesiach
Výber reprezentatívnej modelovej zmesi proteínov
v proteínovom výživovom doplnku Wobenzym
Názov enzýmu
Množstvo
(mg)
Substrátová
špecifickosť
amyláza
10
bromelain
45
chymotrypsín
1
lipáza
10
papaín
trypsín
pankreatín
60
24
100
polysacharidy
proteíny, peptide
amidy
peptidy amidesy
estery
triglycerides, fats
and oils
proteins, peptides
peptides
-
pH optimum
katalytickej
aktivity
717
6,3418
Relatívna
molová
hmotnosť
55 90519
4,5-7,520
9,5520
28 50021
822
8,823
25 00022
7,724
5,825
45 00026
4-727
7,5-8,530
-
9,528
10,530
-
23 45329
23 50031
-
Izoelektric ký
bod
Enzýmové zloženie produktu Wobenzym a niektoré fyzikálnochemické vlastnosti prítomných enzýmov:
a Množstvo enzýmu v 1 tabletke uvádzané výrobcom.
B Pankreatín je zmes pankreatických enzýmov v cicavcoch. Zahŕňa proteázy (trypsín a chymotrypsín) a
exokrinné pankreatické enzýmy (α-amyláza a lipáza). Pankreatín tiež obsahuje ďalšie enzýmy a iné
látky bez enzýmovej aktivity.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
ITP-CZE separácie produktov enzymatickej hydrolýzy
Cytochrómu C po ich HPLC frakcionácii
2
1
HPLC frakcionácia produktov enzymatickej
hydrolýzy Cytochrómu C
4
3
5
6 .0
2 3 .5
4 1 .0
tim e (m in)
A
5
4
3
2
Off-, resp. on-line spájanie vysokoúčinných
separačných ortogonálnych metód
- rozlíšenie väčšieho počtu produktov
enzymatickej hydrolýzy Cytochrómu C
- získanie komplexnejších informácií o
produktoch
ITP-CZE separácia produktov enzymatickej
hydrolýzy Cytochrómu C a jednotlivých HPLC
frakcií
1
1610
2010
2410
tim e (s )
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
ITP-CZE separácie produktov enzymatickej hydrolýzy
Cytochrómu C na elektroforetickom čipe
C yto c hro m C
4 0  g /m l
20 mV
G
450
675
900
T im e (s )
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
Separácie proteínov na elektroforetickom čipe
CyC = Cytochrome C
A = Avidin
C = Conalbumin
HH = Human hemoglobin
TI = Trypsin inhibitor
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
HPLC-MS analýza - tryptic digest modelového proteínu (myoglobin)
T119-133 - HPGDFGADAQGAMTK
T32-42 – LFTGHPETLEK
T17-31 – VEADIAGHGQEVLIR
T134-139 – ALELFR
T64-77 – HGTVVLTALGGILK
T103-118 – YLEFISDAIIHVLHSK
T97-102 – HKIPIK
T1-16 – GLSDGEWQQVLNVWGK
HPLC-MS záznam separácie zmesi peptidov získaných enzymatickým štiepením myoglobínu
trypsínom. HPLC kolóna – Reprosil Gold C18 (100x2,0 mm; 5 μm); injektovaný objem 5 μl;
prietok mobilnej fázy 0,2 mL/min.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Dosiahnuté výsledky v projekte:
HPLC-MS analýza - tryptic digest modelového proteínu (myoglobin)
Inten.(x1,000,000)
1.75
424.5498
1.50
1.25
1.00
0.75
185.1096
0.50
0.25
229.1376
409.9013
579.7955
0.00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
m/z
MS spektrum peptidu T32-42 (m/z 424,54)
Inten.(x100,000)
418.5455
506.2443
3.5
3.0
2.5
2.0
571.2718
233.1543
1.5
358.6855
0.5
LCMS-IT-TOF analyzátor použitý na analýzu peptidov
získaných enzymatickým štiepením trypsínom
716.3657
1.0
52.5720 278.1163
158.4038
689.3552
973.4907
1192.2881
0.0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
m/z
MSMS spektrum peptidu T32-42 (m/z 424,54)
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Zámer/výhľad ďalšieho postupu riešenia
projektu v nasledujúcom období:
o Dokončenie obstarania časti spotrebného materiálu
o Príprava výstupov (publikácií ako aj riešení z výsledkov
získaných z produkcie rekombinantných proteínov a
analytických metód)
o Príprava dlhodobého strategického výskumného plánu
spoločného pracoviska s partnerom hameln rds Modra a
jeho nových výskumných zámerov.
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Kolektív riešiteľov z Katedry molekulárnej biológie
a Katedry analytickej chémie PriFUK
Doktorandi a diplomanti:
Michaela Kandričáková
Hana Halászová
Eva Šliková
Veronika Komorowska
Výskumní pracovníci:
Jozef Marák
Ján Turňa
Stanislav Stuchlík Milan Hutta
Lucia Bocánová
Ján Krahulec
Hana Drahovská Viera Cimová
Janka Ráczová
Marián Masár
Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/
Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ

similar documents