實驗背景

Report
分子生物學實驗(一)
實驗一
蘇力菌質體DNA抽取與
洋菜膠電泳分析
指導老師:蔡銘祝
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目錄
 實驗背景
 實驗目的
 實驗原理
 實驗設備及材料
 實驗方法
 實驗結果
 問題與討論
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實驗背景
蘇力菌是一種昆蟲病原細菌,屬革蘭氏陽性桿菌,在營
養缺乏或環境不良的時候,蘇力菌會進入不分裂的半靜
止期,或分化形成孢子和殺蟲晶體蛋白質。
殺蟲結晶蛋白質
孢子
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實驗背景
• 質體是一種環狀的DNA分子,通常只有數千個鹼基配
對(kilo-base, kb),期生理特性與染色體相同,同樣具
有自我複製的能力。
• 表現蘇力菌殺蟲晶體蛋白質的基因,稱為cry基因,大
多位在大小約60-300 kb的質體上(plasmid)。
• 在同一個質體上,時常具有一種以上cry基因同時存在。
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蘇力菌殺蟲晶體蛋白質之分類
Cry是殺蟲基因名稱,其中包含以下幾種:
• Cry1對鱗翅目有毒殺蟲效果。
• Cry2對鱗翅目及雙翅目或單獨對雙翅目有效。
• Cry3只對鞘翅目有效。
• Cry4只對雙翅目有效。
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實驗目的
本實驗以市售見達利生物性農藥產品為檢測物,上
面標示具有毒殺鱗翅目昆蟲的蘇力菌殺蟲基因,進一
步培養其中之蘇力菌,並且抽取含有殺蟲基因之質體
(plasmid),以作為後續蘇力菌殺蟲基因檢測(PCR)之
模板DNA或限制酶切割及電泳分析等分生實驗。
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實驗原理
•自見達利生物性農藥中大量增殖蘇力菌,利用改良式
鹼裂解法(Modified Alkaline lysis method) 使菌
體分解或破碎,以釋出質體DNA,配合管柱層析法
(column chromatography)方法,將質體DNA純化萃取
完成。
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實驗設備與材料
• 材料
1. LB(Luria-Bertani )培養液
2. 微量離心管、微量吸管(Pipette)
3. 見達利蘇力菌生物性農藥
4. 質體DNA 抽取套組
5. 洋菜膠(agrose)
6. TAE Buffer
7. 6X DNA loading dye
8. HealthView Nucleic Acid Stain
• 設備
1. 滅菌釜
2. 無菌操作台
3. 迴轉式培養器
4. -20℃冰箱
5. 震盪器
6. 桌上型離心機、高速離心機
7. DNA水平電泳槽(Major Science)
8. 鑄膠器套組
9. 冷螢光照相系統
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實驗方法
一、蘇力菌隔夜培養
1、先配置LB培養液
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2、將配置好的培養液放進滅菌釜殺菌2小時。
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3、秤取0.01g蘇力菌粉末,在無菌操作台將其接種到LB培養液中。
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4、將接種完成之LB培養液,放置旋轉培養器中,調整140 rpm,
25℃隔夜培養。
5、隔夜培養後的成果,沉澱物是蘇力菌的菌體。
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二、收集蘇力菌質體DNA流程
離心收集菌體
打破蘇力菌之菌體
中和反應
蘇力菌質體DNA結合到親和性管柱上
清洗雜質
沖提回收蘇力菌質體DNA
質體DNA可長時間保存於-20℃冰箱
細部流程請同學參
照老師上課講解之
英文實驗步驟
萃取蘇力菌質體DNA利用之實驗套組
蘇力菌質體抽取套組:PD1、 PD2、 PD3 Buffe 、 W1 Buffer、Wash Buffer
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三、洋菜膠體電泳
1. 將上週保存於-20℃之蘇力菌質體DNA解凍,混
合均勻後,在室溫中以微量離心機離心5秒鐘,
使溶液集中於微量離心管底部
2. 製作1.5%洋菜膠(取1.5克之洋菜粉溶解於100毫升
之1倍TBE緩衝液中,以微波爐加熱煮沸,待降
溫後,加入1ul HealthView Nucleic Acid Stain進
行後續質體DNA染色
3. 然後將洋菜膠倒入鑄膠槽中,於鑄膠器上方加入
塑膠檢體齒,待其完全冷卻並凝固後方可使用),
如下圖所示
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以1倍TAE電泳緩衝溶液配置1.5%洋菜膠。
圖2
圖1:秤1.5%洋菜膠
圖1
圖2:TAE電泳緩衝溶液
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1.5%洋菜膠配置步驟
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4.將含洋菜膠之膠片盤置於核酸電泳槽中,倒入1倍TAE緩衝液至洋
菜膠表面淹沒為止。
5.取5µl之DNA標幟(1kb marker)與5μl質體DNA,分別與1μl的6倍染
劑在臘膜上以微量吸量管進行混合。
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6. 緩慢的將上述樣品注入1.5%洋菜膠樣品槽中
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7. 蓋上電泳槽蓋,正確接上正、負極,通以100毫伏特之電壓約
30分鐘,注意染劑移動的位置。
8. 當染劑距洋菜膠下方約1.5公分時即完成電泳步驟,關閉電源。
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四、質體DNA電泳結果影像擷取
1、將膠體樣品放入冷螢光照相系統。
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2、蓋上蓋子後,開啟Omega Lum G程式,進行拍照。
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3、擷取影像結果為下圖。(參考用非實驗真實影像結果)
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結果(參考用非實際結果)
Mr 1
2
3
4
5
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7
1:Cry1A(490bp)
2:Cry1B(367bp)
3:Cry1C(1160bp)
4:Cry1D(290bp)
5:質體1
6:質體2
7:質體3
1500bp -
1000bp -
750bp -
500bp -
250bp -
商業上所使用的蘇力菌種─aizawai─的Cry
基因圖譜。PCR的結果以1.5%的洋菜膠體
電泳進行檢視,所使用的分子量標記(Mr)
大小如圖左標示。
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問題與討論
1. 請說明那些因素會影響抽取質體DNA之品質與濃度?
2. 請同學討論蘇力菌質體DNA萃取量偏低之可能原因?
3. 蘇力菌質體DNA使屬於high copy number或low copy
number之質體DNA,試說明解釋?
4. 萃取之蘇力菌質體DNA,在進行後續限制酶切割、聚合酶
連鎖反應、DNA定序等實驗,如果發現結果不佳,有可能
是那些原因造成,試說明解釋?
5. 本實驗利用DNA電泳可以將蘇力菌質體DNA進行半定量分
析,請問如何更精準定量蘇力菌質體DNA之含量?
6. 請問同學如何檢測所萃取蘇力菌質體DNA之純度?
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