Les mutations dans le gène APC

Report
Apport de la génétique dans
le cancer colo-rectal familial
A. CHIKOUCHE, M. AIT-ABDALLAH, L. GRIENE et Y. OUKACI
CPMC
Introduction
• Le Cancer Colorectal ou CCR est un problème de santé
publique
• Représente ~13 % des cancers.
• 3ème cause de cancer chez l’homme et 2ème cause chez la
femme dans certain pays, 2ème cause en Algérie.
• Son incidence augmente avec l’âge.
• Les facteurs à l’origine mal connus [alimentation (régimes
riches en graisses animales) et le tabac].
• Complique certaines pathologies: adénome colique, maladie
de Crohn et rectocolite hémorragique.
• Formes héréditaires: cause génétique (prédisposition)
• Devant tout cas de CCR, une consultation d’oncogénétique
est mise en route et des analyses moléculaires sont
indiquées (l’analyse des microsatellites etc.…).
2
Cancer Colorectal
Sporadique (~60%)
Familial (~30%)
Syndromes rares (~4%)
HNPCC (3-5%)
PAF (<1%)
3
Carcinogénèse
4
Formes familiales
Polypose adénomateuse
Polypose
adénomateuse familiale
Gène: APC
CCR familiaux sans adénomes
Sd de Lynch-HNPCC
Gènes: MSH2, MLH1
et MSH6
Sd adénomes multiples (récessives)
Gène: MYH
Prédispositions familiales
CCR familiaux
5
Sans mutation connues
Polypose adénomateuse familiale
•
•
•
•
•
•
~ 1 % des cancers colorectaux.
Due à des mutations du gène APC (adenomatous polyposis coli)
Incidence 1 pour 10.000
100 à 1000 polypes (comptage par Chromoscopie )
Risque de 7% d’avoir un CCR à 21 ans et de 93% à 50 ans
Peut se présenter sous une forme classique avec des:
• Manifestations malignes telles que les médulloblastomes, le cancer de
la thyroïde, le cancer colique, des Hépatoblastomes.
• Manifestations bénignes telles que l’hypertrophie de l’épithélium
pigmentaire de la rétine, des anomalies dentaires, des ostéomes de la
mâchoire, des kystes épidermoïdes, des polypes glandulokystiques
• Tumeurs desmoides
• Ou sous une forme atténuée (très rare)
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Gène et protéine APC
•
•
•
•
•
Gène APC: localisé en 5q21,
Suppresseur de tumeur
Longueur de 120 Kb,
Séquence de 8535 pb codée par 15 exons (15ème très important).
Protéine: 310 Kd, 2843 AA
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Rôles de la protéine APC
• Régulateur négatif de la voie Wnt / b-caténine ,
• Dans l’organisation du cytosquelette par son association
aux microtubules.
• Dans divers processus physiologiques de la croissance
cellulaire à l'apoptose
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Génétique de la PAF
• Transmission autosomique dominante: avec pénétrance complète
(50% de risque d’être atteint si un parent est atteint)
• Due à des mutations du gène APC, retrouvées dans 90% des cas
• Inactivation du gène APC: Activation permanente de cette voie de
signalisation Wnt avec augmentation de la prolifération cellulaire
incontrôlée (cancer).
• Plus de 30% des patients ont des mutations germinales de novo
• Plusieurs familles ont des mutations uniques
• Dans la tumeur, selon l’hypothèse de Knudson , 1 mutation
germinale + 1 mutation ou perte d’hétérozygotie (LOH).
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Les mutations dans le gène APC
Codon 1309
Codon 1061
5'
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 14
3'
15
• Prés de 1400 mutations.
• Petites délétions (majorité): protéine tronquée,
• Mutations faux-sens ou non-sens, petites insertions, grandes délétions,
des mutations dans des sites d'épissage, de petites délétions
/insertions, de grande insertions et des réarrangements et des
mutations dans les séquences régulatrices.
• MCR (mutation cluster region) est entre les codons 1000 à 1600.
• Mutations: Délétion de 5 pb au codon 1061 (c.3183_3187delACAAA)
10 et
au codon1309 (c.3927_3931delAAAGA) = les plus fréquentes.
Fortes corrélation phénotype/génotype dans la PAF
11
Polypose récessive
• Nombre moyen des polypes = 55
• Age moyen de diagnostic = 30-50 ans
• Due à des mutations du gène MYH ou MUTYH
• Gène MYH; 1p34.3-p32.1, 16 exons, 11147 pb
• Protéine: 1854 pb; 535 acides aminés, PM: 52 kDa
• Adénine glycosylase: Protéine impliquée dans le système «
Base excision repair » (BER) ou réparation par l'excision de
base
• Mutations = diminution de l’activité adénine glycosylase
• 30% des cas = mutations homozygotes (biallélique) :
Y165C dans l’exon 7 et G382D dans l’exon 13
• Mutations type faux-sens, non-sens, décalage du cadre et
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mutations d'épissage
Autres polyposes
•
•
•
•
•
•
Syndrome de Peutz-Jeghers
<1% de tous les cas de CCR
Transmission autosomique dominante
Présence de polypes Hamartomateux vers la 1ere décade
Hyperpigmentation mucocutanées glt vues chez les enfants < 5 ans
Risques de Cancer (colon, intestin grêle, estomac, pancréas, seins, ovaires,
utérus, testicules, poumons, reins
• Mutations dans le gène STK11 (19p13.3),
– Code une protéine de la famille des sérine-thréonine kinases
– Retrouvées dans 70% des cas familiaux et 30-70% des cas sporadiques
•
•
•
•
Polypose Familiale Juvénile
<1% de tous les cas de CCR
Transmission autosomique dominante
5 polypes juveniles ou plus dans le colon ou tractus gastrointestinal
– Apparaît au cours de la 1ére ou 2éme décade
– Risque de cancer gastrique, pancréatique
• Les gènes SMAD4/MADH4, (18q21.1 ) et BMPR1A/ALK3, (10q22-23) qui
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ont un rôle important dans la voie enzymatique du TGF, sont impliqués
CCR familiaux sans adénomes
Le syndrome de Lynch ou syndrome HNPCC
• Maladie héréditaire à transmission autosomique dominante.
• Critères cliniques
• Critères d’Amsterdam-I
– Au moins trois sujets atteints de cancer du côlon confirmés
histologiquement et dont au moins un est parent au premier degré
des deux autres
– Les cas sont répartis sur au moins deux générations successives
– Au moins un des cas est diagnostiqué avant l'âge de 50 ans
– La polypose familiale est exclue
• Critères d’Amsterdam-II (Critères d’Amsterdam-I avec)
– cancer du spectre HNPCC restreint (côlon, endomètre, intestin
grêle, voies urinaires)
• Critères de Bethesda-II
– Un second cancer colorectal synchrone ou métachrone ou autre
tumeur du spectre HNPCC élargi (endomètre, intestin grêle, voies
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urinaires, estomac, ovaires, pancréas, voies biliaires, cerveau)
CCR familiaux sans adénomes
Le syndrome de Lynch ou syndrome HNPCC
• Du à l’altération d’un des gènes qui participent au système de
réparation des mésappariements de l ’ADN (MMR pour
MisMatch Repair)
• Plusieurs gènes identifiés.
– MLH1; 3p21.3 (MutL homolog 1, 19 exons)
– MSH2; 2p22-p21 (MutS homolog 2, 16 exons)
– MSH6; 2p16 (10 exons),
• Autres gènes: PMS1 (2q31-33), PMS2 (7q22) et MLH3
( 14q24.3).
15
Réparation des mésappariements
16
Les mutations dans le syndrome de Lynch
MSH2
~30%
Inconnue
~30%
MLH1
~30%
MSH6 (5 à 10 % )
Autres gènes (rare)
• Prés de 300 mutations dans MLH1 et dans MSH2
• Type de mutation:
– Substitutions nucléotidiques (faux-sens, non-sens et des erreurs
d'épissage) et les insertions / délétions (grandes ou petites).
• la protéine obtenue est tronquée.
– Hyperméthylation du promoteur de MLH1
• Ces mutations sont hérités dans un allèle et plus tard l'autre allèle est
perdue par LOH dans la tumeur.
• Ces gènes sont responsables d’une caractéristique tumorale appelée MSI
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(MicroSatellite Instability) ou phénotype RER (replication error).
Principe de l’instabilité des microsatellites.
• Microsatellites ou STRs (short tandem repeats) =
séquences répétées, à localisation variable dans le génome
• Instabilité des microsatellites (MSI, microsatellite instability)
se caractérise par la modification d’un grand nombre de
séquences répétées dans le génome des cellules tumorales
par rapport aux cellules normales d’un même individu.
• Découverte par hasard dans les années 1990.
18
Mécanisme du mésappariement - Principe général
19
DIAGNOSTIC GÉNOTYPIQUE
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Recherche génétique dans la PAF
• Test proposé après conseil génétique, information et
consentement éclairé.
• Une demande, un résumé clinique et un arbre généalogique
• Se fait sur un prélèvement de sang
• L’étude du gène APC peut confirmé un diagnostic suspect.
• Les membres de la famille avec une mutation connue
bénéficie de la recherche spécifique de cette mutation
• La recherche de la mutation chez les enfants à risques pour
la PAF peut être envisagée avant de commencer le
screening du colon.
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Stratégie d’étude génotypique dans le cas de la PAF
Clinique
Dominante
Récessive
Séquençage MYH (14 amplicons)
Séquençage APC (31 amplicons)
Etude des exons selon la clinique
+
Sinon commencer par l’exon 15
Mutation
+
-
Mutation
Pas de Mutation
-
Recherche de réarrangement
MLPA
Surveillance familiale digestive
+
Enquête familiale,
surveillance, prise en
charge des porteurs
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de la mutation
Recherche génétique dans le syndrome
HNPCC
• Une demande avec un résumé clinique
• Un arbre généalogique
• Une fiche de consentement
• Prélèvements
– Prélèvements de tumeurs
– Prélèvement de sang
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Stratégie d’étude génotypique
dans le cas du CCR
Critères d’amsterdam ou de Bethesda
+
-
Etude génétique (consentement)
Etude génétique non faite
(Tumeur) Statut MSI
-
+
Recherche de la V600F (BRAF)
MSS
+
MSI
Cancer sporadique avec
hyperméthylation de MLH1
IHC (MLH1, MSH2)
(Sang) Séquençage MLH1 (19 a), MSH2 (16 a) et MSH6 (19 a)
+
-
Mutation
Pas de Mutation
-
Arrêt de l’étude
Recherche de réarrangement
MLPA
+
Enquête familiale,
surveillance
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Autres gènes ?
Étude des microsatellites
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Entité MSI (microsatellite instability ou instabilité des microsatellites)
L’analyse MSI
• Test positif = perte de la fonction du système de
réparation des mésappariements (MMR) dans des
tumeurs et qui conduit au cancer.
• 95% des tumeurs HNPCC sont MSI+
• 10%–15% des cancers sporadiques sont MSI+
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L’analyse MSI
• Intérêts:
• Tumeur avec statut MSI positif = forme familiale
• Tumeur avec statut MSI positif = meilleur pronostic.
• Adaptation du traitement adjuvant (5 fluouracile et
d’acide folique)
– efficace pour les tumeurs dont le phénotype est
stable.
– inefficacité chez les malades ayant une tumeur
MSI+.
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L’analyse MSI
• Indication: Recherche de MSI chez tout CCR avant l’âge
de 60 ans.
• Etude par amplification de microsatellites sur des
prélèvements de tumeurs (tissus frais, congelé ou
coupes en paraffine).
• Technique réalisée par analyse de fragments.
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L’analyse MSI
• La technique est basé sur la migration éléctrophorétique de produits
PCR marqué par des fluorochromes dans un capillaire (séquenceur).
• On utilise un standard interne pour mesurer les tailles des fragments
obtenus.
Protocole pour l’analyse MSI
Extraction de l’ADN
à partir de tumeur
Préparation du mélange PCR
Amplification
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Analyse de fragment par séquençage
Mise en évidence d’une MSI (phénotype RER)
•
•
•
•
•
•
5 marqueurs microsatellites (poly A ou T) utilisés
ADN normal: 1 marqueur: 1 bande normale
ADN tumoral: 1 marqueur: La bande normale + autres plus petites
Petite bande: délétion: instabilité des microsatellites
3 ou plus de marqueurs instables (≥ 3 marqueurs/ 5) = MSI positif
0, 1 ou 2 marqueurs instables = MSI négatif ou MSS.
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Exemple de résultats MSI
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Protocole pour Séquençage
Extraction d’ADN à
partir du sang
Amplification PCR
Préparation du Mix PCR
Migration électrophorèse
Photo
Visualisation des bandes d’ADN
PCR de
séquence
Purification
Purification
Electrophorégramme
Séquençage
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Amplification d’ADN par la PCR
• Mullis, Prix Nobel 1993
• But:
• Obtenir une quantité d’ADN
suffisante pour les analyses
futures.
Principe:
augmentation du
nombre de copies
d’ADN
Répétition des cycles
(30)
Quantité de copie 230
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La réaction de séquence
• Après purification des produits PCR
• Principe (méthode de Sanger:
– Consiste à faire synthétiser un brin
d’ADN qu'on désire séquencer en
prenant comme matrice le brin
complémentaire par une ADN
polymérase, avec une incorporation
aléatoire de didésoxynucléotides qui
bloquent la synthèse.
• Chaque type de ddNTP porte un
fluorochrome spécifique (nombre 4).
• les produits de la réaction de séquence
purifiés sont déposés sur un séquenceur
ABI Prism 3130 où ils sont séparés par
électrophorèse capillaire.
• Les différents fragments, une fois séparés,
sont détectés par émission de fluorescence
après excitation par une source lumineuse.
• L’électrophorégramme (séquence) obtenu
est comparé à la séquence de référence.
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Exemple de résultats de séquençage
Mutation de MLH1: insertion de 2 nucléotides CA
35
La MLPA
Multiplex Ligation Probe Amplification
• Amplification simultanée de séquences-sondes hybridées
sur des séquences ADN cibles spécifiques en une seule
réaction PCR multiplex
• Méthodes de détection des changements du nombre de
copie de séquences d’ADN ou de simples exons .
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Exemple de résultats par MLPA
Sain
Patient
Délétion des exons 1-6
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Intérêts de l’étude des gènes BRAF et KRAS
dans le CCR
• EGFR et son ligand type sauvage
• Utilisation d’un anti EGFR
• Mutation du KRAS et Mutation du BRAF = activation
constitutive de la voie EGFR (indépendante de la fixation du
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ligand à son récepteur), en aval du récepteur.
Mutations du gène BRAF et CCR
•
•
•
•
BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)
7q34 , 18 exons , 190284 bp
Protéine codée par 2478 bp, 766 acides Amines, PM: 84436 d.
Famille des gènes RAF codant pour des kinases régulées par les gènes Ras et
impliquées dans la réponse cellulaire aux signaux de croissance.
• Mutations impliquées dans d’autres cancers (thyroïde)
• La présence de mutation du gène BRAF est corrélés à l'absence
de réponse au traitement par des thérapies anti-EGFR.
• La mutation V600E (pour certains auteurs, V599E) dans l’exon
15 est associée au statut MSI positif dans environ 40 % de
tumeurs coliques sporadiques (mais, non au syndrome HNPCC)
mais mécanisme en cause non connu.
• Cette mutation serait étroitement corrélée à l’hyperméthylation
du gène MLH1 et donc à l’absence de son expression.
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Mutations du gène KRAS et CCR
• KRAS localisé 12p11.22 est un oncogène (Kirsten Rat Sarcoma virus).
• Six exons, taille 35kb
• La protéine KRAS de 21KD, localisée sur la face interne de la membrane
plasmatique et possède une activité de GTPase, est une composante essentielle de
la cascade de transduction du signal en aval du récepteur membranaire EGFR
• Mutations somatiques détectées dans des cancers (poumon, colon,
pancréas et thyroïde).
• Mutations activatrices, retrouvées dans environ 30% des CCR.
• Essentiellement associées à un cancer du côlon sans instabilité de
microsatellites
• Les mutations les plus fréquentes sont détectées dans les codons 12
(~82% des mutations KRAS) et 13 (~17%) de l’exon 2 du gène KRAS.
• Présence d’une mutation = absence de bénéfice clinique aux
traitements anti-EGFR tels que les anticorps monoclonaux antiEGFR (cetuximab et panitumumab).
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Conclusion
• Le diagnostic des prédispositions aux CCR nécessite une collaboration
étroite entre les différents intervenants (médecin traitant,
gastroentérologue, biologiste, chirurgien et oncologue).
• L’identification des formes héréditaires des cancers colorectaux est
nécessaire à la bonne prise en charge adaptée des malades et de leur
famille et les moyens de prévention sont possibles et efficaces.
• L’absence de reconnaissance de telles formes met en jeu le devenir
non seulement des malades mais aussi de leurs apparentés.
• L’étude génétique apporte une aide précieuse mais doit être
orientée par une bonne clinique et un diagnostic
anatomopathologique poussé (immunochimie)
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Merci

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