Dispersión de luz - Laboratorio de Fisicoquímica Biológica

Report
Dispersión de luz
(light scattering)
Matías Möller
Fisicoquímica Biológica
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Dispersión de luz
• Por qué el cielo es azul?
• Cómo se ve el cielo de la luna?
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Dispersión de luz
John William Strutt
Lord Rayleigh
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Dispersión de luz
El fotón incidente induce un dipolo oscilante en la nube electrónica.
Al cambiar el dipolo, la energía se irradia-dispersa en todas direcciones.
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Dispersión de luz por proteínas
• Intensidad de luz dispersada es proporcional a la masa
molecular y concentración
• Sensible a la presencia de pequeñas cantidades de agregados
• Polidispersity (homogeneidad) control de calidad,
cristalización de proteínas
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Dispersión de luz por proteínas
Se puede analizar de diferentes maneras:
• Intensidad promedio (Estática)
(SLS, static light scattering)
• Fluctuaciones en la intensidad (Dinámica)
(DLS, dynamic light scattering)
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Dispersión de luz estática
• Medida de masas moleculares
Intensidad promedio de dispersión es función de la masa
molecular y el 2do coeficiente virial
K = constante óptica
MM = masa molecular
A2 = 2do coeficiente virial
C = Concentración (g/L)
Rq = relación de Rayleigh
(término que incluye la intensidad)
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Dispersión de luz estática
Constante
Relación de Rayleigh
Factor de forma,
= 1 si r < 60 nm
(para rm < l/10)
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Dispersión de luz estática
• La intensidad de luz dispersada que produce una macromolécula es
proporcional al producto de la masa molecular promedio y la
concentración de la macromolécula (I α MM.C)
• Si no hay dependencia entre la intensidad de dispersión y el ángulo
de medida, se puede determinar MM con medidas en un solo
ángulo
• Un gráfico de Debye permite la determinación de:
– MM absoluta
– 2do coefciente virial (A2)
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Dispersión de luz estática
• Gráficos de Debye:
Preparar un número de concentraciones de la proteína en un
buffer apropiado
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Dispersión de luz estática
Ecuación de Rayleigh
Una gráfica de KC/Rq vs C debería dar una linea recta
cuyo intercepto a cero concentración será 1/MW y el gradiente A2
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
2do coeficiente virial
• Propiedad termodinámica que describe la fuerza de
interacción entre la molécula y el solvente
• Si A2 > 0, las moléculas tienden a permanecer en solución (la
proteína prefiere el buffer)
• Si A2 = 0 la fuerza de la interacción proteína-solvente es
equivalente a la fuerza de la interacción proteína-proteína (el
solvente se llama solvente theta)
• Si A2 < 0, la proteína tiende a precipitar o agregar
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
Masa molecular de proteínas
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Dispersión de luz estática
Medidas
• En batch/cubeta
• En línea combinado con un paso de
fraccionamiento, principalmente
Cromatografía de exclusión molecular
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Dispersión de luz estática
La masa molecular medida en experimentos de dispersión son
MM promediada por el peso (fracción en g)
Para un sistema simple de dos componentes con proteína monomérica y agregados:
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Dispersión de luz estática
Para determinar MM individuales:
• Fraccionar la muestra
• Combinar medidas de dispersión con un paso
de fraccionamiento  SEC / MALS
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Dispersión de luz estática
(índice de refracción)
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
(índice de refracción)
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Dispersión de luz estática
• Señal de dispersión Rq α MM C
• Debido a alta MM, los agregados dispersan
fuertemente
• Variación angular en la Intensidad de luz dispersada se
relaciona con el tamaño de la molécula
• La luz dispersada por agregados muestra dependencia
angular, mientras que la luz dispersa por monómeros y
dímeros no.
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Dispersión de luz estática
(índice de refracción)
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
• Pros
Determinacion de MM rapida y exacta (promedio) de macromoleculas en solución
Combinando SEC-MALS se puede determinar MM con una precision ± 5%
Dependencia angular de señal de LS detecta agregados
SEC-MALS permite detectar y cuantificar poblaciones de proteinas según sus MM
Puede determinar estado oligomerico de polipeptidos modificados (prot-acidos
nucleicos, glicosilados, etc.
• Contras
Mide MM promedio, necesita separación para distinguir estados oligoméricos
Posible perdida de muestra durante filtración y fraccionamiento
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
DLS
Permite determinar el tamaño
de moléculas y nanopartículas
Mide las fluctuaciones en la
intensidad de dispersión con el
tiempo para determinar el
coeficiente de difusión
translacional (D), y luego el
radio hidrodinámico
La velocidad de fluctuaciones
depende del tamaño de la
partícula - molécula
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Dispersión de luz Dinámica
Fluctuaciones son resultado del movimiento browniano y puede
correlacionarse con el coeficiente de difusión y el tamaño
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Dispersión de luz Dinámica
• La temperatura tiene que ser estable y exactamente determinada
(regular la viscosidad y evitar la convección)
• Las partículas más grandes se mueven más lentamente
• A mayor temperatura, más rápido se mueven las moléculas
• La velocidad del movimiento Browniano está definido por el
coeficiente de difusión translacional (D)
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Dispersión de luz Dinámica
• Las fluctuaciones en la intensidad no son al azar, sino consecuencia
del confinamiento de las partículas a sitios cercanos a la posición
inicial en tiempos muy cortos
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Dispersión de luz Dinámica
Autocorrelación
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Dispersión de luz Dinámica
correlograma
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
Pros
• En cubeta, muy rápida detección de agregados y evaluación de la
polidispersión de la muestra con un amplio rango dinámico
• Adecuado para estudiar cinética de agregación
• Detector disponible para placas, parara screening
Contras
• Mide radio hidrodinámico, es cual es afectado por la forma de la
partícula
• No puede distinguir entre cambios de forma o estado de
oligomerización
• Necesita fraccionamiento para resolver oligómeros presentes en
una mezcla
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Bibliografía
• Protein sizing by light scattering, molecular weight and
polydispersity, Malvern Instruments presentation,
http://nanoparticles.org/pdf/nobbmann.pdf
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