AFLP (Ço*alt*lm** Parça Uzunluk Polimorfizimi)

Report
(Amplified Fragment Lenght Polymorphism)
AFLP (ÇOĞALTILMIŞ PARÇA UZUNLUK
POLIMORFIZIMI)
MOLEKÜLER SISTEMATIKTE KULLANILAN BAZI
TEKNIKLER
PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)
 RFLP (Restriction fragment length
polymorphism)
 AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism)
 DNA Dizi Analizi

AFLP
Bu yöntem PCR dayanarak 1995 yılında Vos ve
arkadaşları tarafından bulunmuştur,
 RFLP ve PCR kullanımı tekniklerini içerir,
 AFLP kullanılan RFLP den daha hızlı, daha az
emek ister ve daha fazla bilgi sağlar,
 Tekrarlanabilirliği fazladır.

Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi,
1990'lar başında uygulamaya sokulmuştur.
 Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve DNA
örneklerini çoğaltmak için PCR kullanılır.
 Değişken sayılı bitişik tekrar polimorfizmlerine
dayalı aleller ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel
elektroforezi ile ayrıştırılır.

Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Analiz
jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar
jelin tepesinde sıkışabilirler ve birbirlerinden
ayırt edilmeleri zor olabilir.
 AmpFLP analizi yüksek oranda
otomatikleştirilebilir. Bu yöntemle kişisel DNA
örnekleri karşılaştırılarak filogenetik ağaçlar
yaratılabilir.



Düşük maliyeti,
hazırlanma ve çalıştırma
kolaylığı gibi nedenlerden
dolayı AmpFLP hâlâ az
gelirli ülkelerde yaygın
olarak kullanılır.
Genomik DNA’nın
restriksiyon enzimi ile
kesimi sonucu oluşan
DNA parçalarının bir
grubunun selektif
amplifikasyonu (seçici
yükseltme) esasına
dayanan bir genotipleme
metodudur.
RFLP ve PCR tekniklerini içeriğinde barındırır.
 AFLP daha fazla bilgi sağlar.
 Moleküler markörler, genomda herhangi bir gen
bölgesi yada gen bölgesi ile ilişkili DNA parçasıdır.
 Bu markörler, polimeraz zincir reaksiyonuna bağlı
olmayanlar(RFLP) ve bağlı olanlar
(RAPD,AFLP,SSR) olarak adlandırılmaktadır. AFLP
tekniği, RFLP tekniğinin kesme-tanıma kısımlarının
PCR ile çoğaltılmasına dayalı bir DNA markır
tekniğidir.





Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı veya polimorfizmi
anlamına gelen AFLP tekniği,
RAPD tekniğini ile RFLP tekniğinin birleştirilmiş formu
olup RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek üzere
geliştirilmiştir. AFLP, toplam DNA’nın kesildikten sonra
PCR reaksiyonuyla çoğaltılması esasına dayanan güçlü
bir tekniktir.
Bu teknikte genomik DNA genellikle önce birisi altı,
diğeri dört bazı tanıyan iki kesim enzimi (RE) tarafından
kesilir.
Kesilen parçaların uçlarına nükleotid dizilişi sentetik
olan DNA`lar eklenir. (Adaptör)



Eklenen sentetik DNA`nın yani adaptörün nükleotid
dizilişini de taşıyan başlatıcı DNA`lar yani primerlerin
kullanımıyla nispeten spesifik DNA çoğaltımı yapılır. Bu
çoğaltma iki aşamada gerçekleştirilir.
İlk aşamada her iki uçtan DNA kesim enzimlerinin
tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici
çoğaltımın yapıldığı ön üretim yapılır.
Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların
kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikinci
ve üçüncü nükleotidler için seçici üretim yapılır.


Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid
dizilişini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik
şartlarda yapılmış olur.
Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklarını dahi
ayırt edebilen poliakrilamid jel üzerinde hareket
ettirilerek farklı genotiplere ait farklılık gösteren
parçacıklar tespit edilir.
AFLP ANALIZI’ NİN BASAMAKLARI:

1. DNA ekstraksiyonu işlemi yapılır.

2. DNA uygun restriksiyon enzimleri ile kesilir. Küt uç
ve yapışkan uç oluşturan enzimler kullanılır.

3. Adaptör moleküllerin restriksiyon enzimleri ile
kesilmiş DNA moleküllerine bağlanır. Adaptörler,
enzimin tanıdığı baz dizilerini, bir de 20 nükleotid
kadar bildiğimiz dizilerden oluşur.
4. Restriksiyon
enziminin kesim
bölgelerine bağlanan
adaptörler ile oluşan
yeni DNA parçaları
amonyum asetat ve
saf alkolle ile
çökertildikten
sonra%70’lik alkol ile
yıkanarak distile su
içerisinde süspanse
edilir.
ADAPTÖR MOLEKÜLLERININ BAĞLANDIĞI DNA
PARÇALARININ ÇOĞALTILMASI IKI AŞAMADA
GERÇEKLEŞTIRILIR:

Ön seçici çoğaltma

Seçici çoğaltma
ÖN SEÇICI ÇOĞALTMA


Bu basamakta iki primer çifti kullanılır. Bu primerler
adaptör DNA’ya komplementer olup adaptör
DNA’lara bağlanırlar.
Bunun ötesinde bu primerlerin 3’-uçları adaptör
sekansından genellikle 1 yada 2 baz daha uzundur.
Ön-Seçiçi PCR’la sadece 3’- ucunda komplementer
gösteren DNA parçacıkları arttırılır. PCR genellikle
15 yada 20 döngüyle tamamlanır.
 AFLP’nin temeli de budur. Burada restriksiyon
enzimleriyle kesilen ve adaptörlerle kapatılan DNA
parçacıklarından sadece yaklaşık olarak 1/16
seçici olarak arttırılır. Diğer bir deyişle bu adımda
restriksiyon- ligasyonla oluşturulan kalıp DNA’larda
yaklaşık 16 kat azalma gerçekleştirilir.

SEÇİCİ ÇOĞALTMA

Ön seçici PCR ürünleri bu aşamada seyreltilerek
seçici PCR’da kalıp DNA olarak kullanılır. Bu
aşamada kullanılan primerler ise ön-seçici PCR’da
kullanılan primerlerle aynı olup 3’-ucunda genellikle
2 veya 3 nükleotid uzunluğunda fazla baz bulunur.
Her bir PCR için sadece bir çift primer kullanılır. PCR
genellikle 30-35 döngüde tamamlanır.

5. Bu şekilde PCR için gerekli kalıp DNA
hazırlanmış olur.

6. PCR ile çoğaltılan DNA fragmentleri agaroz
jel elektrofezinde yürütülür.

7. Analiz için gerekli veriler şekildeki cihazdan
elde edilen grafiklerdir. Bu grafikler “AFPL
skorlama” programları ile elde edilir.
AFLP SKORLAMA
Geliştirilen AFLP skorlama programları, oluşan
DNA fragmentlerinin matematiksel olarak ifade
edilmesini sağlamaktadır.
 Bu şekilde oluşturulan veri bankaları, hem
verilerin yorumlanmasını kolaylaştırmakta hem
de sonuçların global karşılaştırılmasını
sağlamaktadır.

ÖNEMİ

AFLP taksonomik
çalışmaları desteklemek
için büyük ölçüde kabul
edilmiştir. Çünkü AFLP
aynı genomiğe sahip
türlerin birbirleri
arasındaki ilişkileri net bir
şekilde açıklar. Böylece
tüm canlı gruplarının
sınıflandırılmasında büyük
önem taşımaktadır.
AFLP’NİN KULLANILDIĞI ALANLAR:
Genom haritaları,
 Bireysel genotipin tanımlanması,
 DNA polimorfizminin saptanması,
 Kantitatif özellik lokuslarının saptanması,
 Ebeveyn ve akrabaların tespiti,
 Hastalık ve genetik defektlerin teşhisi,
 Adli tıpta.

AVANTAJI


Tek bir reaksiyonda 30-150
bölge tanımlanabilmesi,
Sonuçların tekrarlanabilir
olması en önemli avantajını
oluşturmaktadır.
DEZAVANTAJI



Pahalı olması,
Laboratuvar ekipmanına
gereksinim duyulması,
Dominant markör olmasıdır.
KAYNAKÇALAR:
www.google.com
 www.wikipedia.com
 www.google.com/görseller

DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜRLER… 
EZGI ÇELİK 200920102052

similar documents