PCR

Report
‫به نام پروردگار‬
‫یادآوری‬
‫• گروه بندی و انتخاب موضوع تحقیق؟‬
‫– نحوه ارایه‪ :‬پاورپوینت‪ -‬تحقیق در چند صفحه همراه منابع‬
‫• تعریف بیوتکنولوژی‬
‫– مثالهایی از بیوتکنولوژی کالسیک‬
‫– بیوتکنولوژی مدرن‬
‫• کلونینگ چیست؟‬
‫• تراریخت چیست؟‬
‫• انسان شبیه سازی شده؟‬
‫بیوتکنولوژی‬
‫جلسه دوم‬
‫‪PCR‬‬
‫واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز‬
Polymerase chain reaction
Adenine
Guanine
Purine
P y r im i d i n e
Cytosine
Thymine
Uracil
Thymine
Adenine
Adenine
Cytosine
Guanine
Guanine
Thymine
Cytosine
DNA ‫همانند سازی‬
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Primase
Laging Strand
Okazaki
fragment
5’
RNA
Primers
3’
Single strand
binding
proteins
5’
DNA
Polymerase
5’
3’
Helicase
Leading Strand
5’
3’
DNA ‫آنزیم های کلیدی در همانند سازی‬
• DNA Polymerase
•
•
•
•
•
DNA Ligase
Primase
Helicase
Topoisomerase
Single strand binding protein
‫‪ PCR‬چیست؟‬
‫• روشی که در آن قسمت خاصی از ‪DNA‬الگو توسط آنزیم‬
‫پلیمراز در سیکلهای گرمایی تکثیر می گردد‬
‫• جایگزین روش کلونینگ ژن در باکتری‪:‬‬
‫– ساده تر‬
‫– کم هزینه تر‬
‫– سریعتر‬
‫تاریخچه‬
‫كری‌ موليس‬
‫• ‪‌ 1985‬‬
‫• ‪ 1993‬برنده نوبل‬
‫دالیل پیشرفت این روش‬
‫• ‪DNA‬پلیمراز مقاوم به حرارت‬
‫• دستگاههای ترمال سایکلر‬
‫مواد مورد نیاز‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫آب دیونيزه‬
‫پلیمراز(‪(Taq‬‬
‫نوکلئوتید)‪(dNTPs‬‬
‫پرایمرها‬
‫بافر آنزیم‬
‫کوفاکتور‌)‪(Mg‬‬
‫الگو)‪(DNA‬‬
‫مراحل واکنش ‪PCR‬‬
‫• دناتوراسیون اولیه‬
‫• مراحلی که چندین سیکل تکرار می شوند‬
‫– دناتوراسیون‌‬
‫– اتصال پرایمرها‬
‫– طویل شدن‬
‫• طویل شدن نهایی‬
Overview of PCR
Temperature Cycling .1
94°
55°
72°
Denaturation
Annealing
Extension
2. Every cycle DNA between
primers is duplicated
PCR Amplification
Exponential Amplification
Temperature
100
Melting
94 oC
PCR
50
0
T i m e
3’
5’
5’
3’
Temperature
100
Melting
94 oC
PCR
50
0
T i m e
3’
5’
Heat
5’
3’
Temperature
100
Melting
94 oC
50
0
PCR
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
T i m e
3’
5’
5’
5’
5’
3’
Temperature
100
Melting
94 oC
50
0
PCR
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
T i m e
3’
5’
Heat
5’
5’
Heat
5’
5’
3’
30x
Temperature
100
Melting
94 oC
50
0
PCR
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
T i m e
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
30x
Temperature
100
50
0
3’
5’
5’
Melting
94 oC
PCR
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
T i m e
5’
5’
5’
3’
Heat
5’
5’
Heat
5’
30x
Temperature
100
50
0
3’
5’
5’
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
T i m e
5’
5’
5’
Melting
94 oC
PCR
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
30x
Temperature
PCR
100
Melting
94 oC
50
0
3’
5’
5’
T i m e
5’
5’
5’
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
5’
3’
Fragments of
defined length
5’
5’
5’
5’
5’
5’
30x
Polymerase Chain Reaction
PCR Product
Plateau phase
Linear phase
End point analysis
on agarose gels
Exponential phase
Cycles
‫الکتروفورز‬
PCR ‫عوامل موثر در‬
•
•
•
•
Reagent and instrument
User mistakes
Template
Primers
‫برخی کاربردها‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫تشخیص بیماری ژنتیکی‬
‫تعیین هویت افراد‬
‫تشخیص بیماری ویروسی‬
‫تیتر ویروسی توسط ‪Real-Time PCR‬‬
‫تکثیر قطعه خاص ژنی برای ژن کلونینگ‬
‫ایجاد جهش برای ژن کلونینگ‬
‫اضافه کردن قطعات خاص برای ژن کلونینگ‬
‫بررسی بیان ژن ‪RT-PCR‬‬
Real Time PCR ‫مقدمه ای بر‬
What’s Wrong With Agarose Gels?
* Low sensitivity •
* Non-automated •
* Size-based discrimination only •
* Results are not expressed as numbers •
* Ethidium bromide staining is not very •
quantitative
Three general methods for the quantitative detection:
1-TaqMan, Beacons, Scorpions
2. Hybridisation probes
3. DNA-binding agents
(SYBR Green)
The first two methods are specific formats.
Fluoresces when bound
to dsDNA
DNA Polymerase 5' exonuclease activity
Taqman probes are “hydrolysis”
probes
Polymerization
5’
3’
5’
Forward
Primer
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’
5’
Reverse
Primer
Displacement
5’
Forward
Primer
R
Q
3’
5’
5’
3’
5’
Reverse
Primer
Hydrolysis
R
Q
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Polymerization Completed
R
Q
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Hybridization probes
Excitation
FRET
Emission
P
Amplicon
95oC
Denaturation
Tm
55oC
Excitation
FRET
Emission
P
Fluorimeter
Reading
Primer/Probe Annealing
72oC
Primer Extension
Molecular Beacons
Scorpion
Product confirmation
Melting curve analysis
Melting peaks
threshold
Ct
SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS
Real-Time PCR Applications
• Quantification of DNA and RNA
• Identify of presence and copy number of
sequence
– Identification and quantification of pathogen
– Diagnosis of disease condition
• Quantitation of Gene Expression
• Array Verification
Real-time PCR advantages
* amplification can be monitored real-time
* no post-PCR processing of products
(high throughput, low contamination risk)
* ultra-rapid cycling (30 minutes to 2 hours)
* requirement of 1000-fold less RNA than conventional
assays
(3 picogram = one genome equivalent)
* detection is capable down to a 2-fold change
* confirmation of specific amplification by melting point
analysis
* most specific, sensitive and reproducible
* not much more expensive than conventional PCR
(except equipment cost)
Real-time PCR disadvantages
* not ideal for multiplexing
* setting up requires high technical skill and support
* high equipment cost
***
* DNA contamination (in mRNA analysis)
‫•موفق باشین‬

similar documents