Spektrofluorometri

Report
JURUSAN FARMASI FKIK
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
Oleh : Hendri Wasito, S. Farm., Apt.
(http : // www.hendriapt.wordpress.com)
Penyerapan energi oleh molekul memungkinkan
terjadinya : ( Eksitasi, Fluorescensi, dan
Fosforescensi)
Banyak senyawa kimia memiliki sifat
fotoluminensi (dapat dieksitasikan oleh cahaya
dan memancarkan kembali sinar dengan panjang
gelombang sma atau berbeda dengan semula).
Ada dua peristiwa fotoluminensi : (Fluorosensi
dan Fosforesensi)
Sebagian molekul dalam keadaan ground state
berada dalam keadaan singlet.
Molekul dalam keadaan :
singlet : spin elektron
triplet : spin elektron
berpasangan
tidak berpasangan
Energi keadaan triplet sedikit lebih
rendah dibanding energi keadaan singlet

Merupakan suatu proses kembalinya molekul yang
tereksitasi ke keadaan asas (dari S1 atau T ke S0) :









Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR)
Konversi didalam (Internal Conversion = IC)
Pradisosiasi
Disosiasi
Konversi keluar
Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX)
Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ)
Fluoresensi (F)
Fosforisensi (P)




Perpindahan energi vibrasi
dari molekul yang tereksitasi
Molekul yang tereksitasi
kehilangan energi eksitasi
vibrasionalnya (lewat
tumbukan) menjadi keadaan
vibrasional S2
Terjadi sangat cepat (10-3)
detik
Dapat terjadi pada tingkat
energi elektronik tereksitasi
atau azas
Perpindahan energi dalam 1
molekul
 Elektron pindah dari tingkat energi
elektronik yang lebih tinggi ke
tingkat energi elektron yang lebih
rendah tanpa memancarkan sinar
(S2  S1 atau T2  T1)
 Dapat terjadi jika kedua tingkat
energi elektronik tersebut
berdekatan, sehingga terjadi
tumpang tindih diantara tingkat
energi vibrasi



Kelanjutan IC
Perpindahan electron
dari suatu tingkat energi
elektronik tereksitasi
(mis S2) ke tingkat energi
vibrasi yang lebih tinggi
dari tingkat energi
elektronik tereksitasi
yang lebih rendah


Putusnya suatu ikatan dalam molekul
karena menyerap energi sinar tanpa
didahului peristiwa konversi kedalam
Elektron ikatan terlepas



Perpindahan energi
elektronik akibat
antaraksi molekul
yang tereksitasi
dengan molekul lain
Tidak ada
pemancaran sinar
Energi yang
dipindahkan adalah
energi elektronik



Pembalikan arah spin
elektron yang tereksitasi dari
tereksitasi SINGLET (S)
menjadi TRIPLET (T)
dapat mudah terjadi jika
tingkat energi vibrasi dari S
overlapping dengan tingkat
energi vibrasi dari T
Terjadi pada molekul dengan
berat molekul tinggi




Intensitas fluoresensi berkurang
Terjadi akibat tabrakan-tabrakan antar
molekul sendiri
Adanya pemadam akan menginduksi
deeksitasi dari suatu molekul analit yang
tereksitasi sehingga tidak ada sinar yang
diemisikan
Contoh : Oksigen bagi senyawa
poliaromatis hidrokarbon




Pemancaran sinar dari S1
 S0
Waktunya amat singkat
(10-8) detik
Jika eksitasi
dihentikan,fluoresensi
terhenti
Emisi foton sama nilainya
dengan energi ang diserap
oleh suatu molekul.





Peroses sutu molekul
melangsungkan suatu transisi
(emisi) dari tingkat triplet ke
tingkat dasar.
Pemancaran sinar dari T1 
S0
Waktunya lebih lama (10-4
detik)
Jika eksitasi
dihentikan,fosforisensi masih
dapat berlangsung
Biasanya didahului oleh L.A.S.
Bilangan yang menyatakan perbandingan
mol yang berfluoresensi dan jumlah total
mol yang tereksitasi (min = 0 dan max = 1)
Catatan Indeks :
K = Tetapan Laju
F = Fluoresensi
IC = Konversi didalam
EC = Konversi keluar
IX = Lintasan antar system
PD = Pradisosiasi
D = Dissosiasi
Faktor Lingkungan
= KIC, KEC dan KIX
Faktor Struktur Kimia = KF, KPD dan KD

EF lebih mungkin terjadi pada transisi  *  
dari pada *  n karena:
 Absorptivitas molar transisi  *   jauh lebih
besar dari absorptivitas molar transisi *  n
 Umur eksitasi   * lebih lama dari pada umur
eksitasi n   * sehingga Kn  * lebih besar dari
pada K  *
 Kix pada   * lebih kecil dari pada KIX pada n 
* , karena energi yang diperlukan untuk
pembalikan arah spin pada   * jauh lebih
besar dari pada n  *




Nilai absortivitas molar merupakan
kebolehjadian
terjadinya transisi, makin
besar  makin mudah terjadi transisi
 makin mudah terjadi fluoresensi.
LAS lebih sulit pada   *, maka
  * Fluoresenensi
n  *  Fosforisensi

PF adalah proporsional dengan jumlah
molekul yang tereksitasi :
dimana : PF = Intensitas fluoresensi
Qf = Effisiensi fluoresensi
P0 = Intensitas yang dikenakan pada sample
P = Intensitas setelah mengenai sample
Jika persamaan 3 dikembangkan
dalam suatu seri maka
Jika  bc kecil maka
Qf = Effisiensi fluoresensi (nilainya tetap)
Po = Intensitas awal (nilainya tetap)
Σ = Absorptivitas molar (nilainya juga tetap)
b = Tebal kuvet (nilainya juga tetap)
Sehingga persamaan menjadi :
Pf
= (Nilai tetap QF, Po, Σ dan b) c
= Kc
Jadi intensitas fluoresensi yang terbaca berbanding
langsung dengan kadar
1. Temperatur (Suhu)
a. EF berkurang pada suhu yang dinaikkan
b. Kenaikan suhu menyebabkan tabrakan antar mol atau
dengan mol pelarut
c. Energi akan dipancarkan sebagai sinar
fluoresensi diubah menjadi bentuk lain misal : EC
2. Pelarut
a. Dalam pelarut polar intensitas fluoresensi bertambah,
karena dalam pelarut polar
b. Jika pelarut yang digunakan mengandung atom-atom
yang berat (CBr4, C2H5I) maka intensitas fluoresensi
berkurang, sebab ada interaksi gerakan spin dengan
gerakan orbital elektron ikatan  mempercepat LAS
maka intensitas menjadi berkurang
3. pH
pH mempengaruhi
keseimbangan bentuk
molekul dan
ionic
OH
λ eks = 285
λ em = 365
Int = 18
Phenol
λ eks = 310
λ em = 410
Int = 10
Phenolat
4. Oksigen terlarut
Adanya oksigen terlarut dalam larutan cuplikan
menyebabkan intensitas fluoresensi berkurang sebab :
a. Oksigen terlarut oleh pengaruh cahaya dapat
mengoksidasi senyawa yang diperiksa
b. Oksigen mempermudah LAS
5. Kekakuan struktur (structural rigidity) Struktur
yang rigid (kaku) mempunyai intensitas yang
tinggi
Fluoren
Bifenil
EF = 0,20
Adanya -CH2- pada fluoren menyebabkan strukturnya lebih
kaku
 Struktur molekul yang mempunyai ikatan
rangkap mempunyai sifat fluoresensi karena
strukturnya kaku dan planar
 EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada
sistem  dapatmenaikkan intensitas
fluoresensi
 EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapat
menurunkan bahkan menghilangkan sifat
fluoresensi
 Penambahan ikatan rangkap (aromatik
polisiklik) dapat menaikkan fluoresensi
Pengaturan pH dapat merubah intensitas
fluoresensi, Contoh :
Phenol menjadi phenolat  menaikkan
fluoresensi
Amina aromatik menjadi ammonium aromatik
 menurunkan fluoresensi
Heterosiklis dengan atom N, S dan O
mempunyai sifat fluoresensi
Heterosiklis dengan gugus NH, jika medianya
asam akan menaikkan intensitas fluoresensi
Sampel cell
Excitation
filter
Light
source
Excitation
(prymary)
filter
Transmitted
Light
Fluorecent
(emitted)
light
Fluorecence
(secondary)
filter
Phototube
Photomultiplier tube
Kepekaan yang baik karena :
1. Intensitas dapat diperbesar dengan
menggunakan sumber eksitasi yang tepat
2. Detektor yang digunakan seperti tabung
pergandaan foto sangat peka
3. Pengukuran energi emisi lebih tepat
daripada energi terabsorbsi
4. Dapat mengukur sampai kadar 10-4 – 10-9
M




Obat yang mempunyai sifat fluoresensi
alamiah dalam hal ini tidak diperlukan
tambahan pereaksi
Contoh : Quinine
Larutan obat ini mengabsorbsi sinar UV dan
mengemisi sinar Vis


. Turunan obat yang dibentuk dengan
pengikatan dengan senyawa berfluoresensi
Contoh : Asam amino diikat oleh syclorida [ 5
–(dimethylamino) naphtalene-1-sulfonylhloride]  dansyl asam aminoyang intensitas
fluoresensinya tinggi
SO23CL
SO3-NH-CHR-COOH
O
R=CH-C
NH2
+
- HCL
OH
N(CH3)2
N(CH3)2

Membentuk molekul berfluoresensi (a.
fluorophore)
H3C
N
S
+ NH
CH2
N
CH2-CH2OH.2CL -
3
N
+
CH3
Fe(CN)6 OH
Vitamin B1
H3C
N
N
N
S
N
Thiochrome
CH2-CH2OH
CH3
Berfluorensi

eks = 365 nm
 em eks = 440 nm
1.
Secara teoritis spektra eksitasi identik dengan
spektra absorsi u.v. Spektra ini dapat
digunakan untuk menentukan  spesifik yang
menyebabkan timbulnya emisifluoresensi/
fosforisensi dan  yang menimbulkan emisi
yang maksimal disebut  eksitasi
1.
Spektra emisi adalah duplikat dari spektra
eksitasi. Hanya timbul pada  yang lebih
panjang.  emisi dipilih suatu  yang
menimbulkan intensitas maksimal







Dibuat cuplikan dalam pelarut air, etanol, maupun sikloheksan
Lar. cuplikan masukkan kedalam kuvet spektrofotometer
Atur monokromator eksitasi pada suatu  didaerah u.v. (misal A).
Kemudian monokromator emisi diputar sampai diperoleh intensitas
yang maksimal misal B nm (B :  emisi)
Atur monokromator, emisi pada B nm dan sekarang
monokromator eksitasi yang diubah sampai diperoleh intensitas
yang maksimum misal A’ nm (A’ nm =  eksitasi)
Monokromator eksitasi diatur pada A’ nm dan buat spektra emisi
dengan merecord intensitas sebagai fungsi dari panjang gelombang
() akan diperoleh harga  yang mempunyai intensitas maksimal
misal : B’ nm
Maka
 eksitasi : A’ nm
 emisi : B’ nm
Senyawa
 eks
 fos
Waktu
Kondisi
Aspirin
240
380
2,1
EPA
Bennocaine
310
430
3,4
Epharm
Cocaine
240
400
2,7
Ethanol
Diazepam
290,325 400,470,510 0,07
EW
Iproniazid
300,370 440
-
EW
Papaverine
260
480
1,5
Ethanol
Phenacetin
410
499
-
EPA
Strychnin PO4
290
440
1,2
Ethanol
Thioridazine
335
500
0,07
EW
EW : Ethanol – water = 1 : 1
EPA : campuran Diethyleter-isopentane-ethanol (5:5:2)

Jelaskan penggunaan fluoresensi dan fosforesensi dalam
analisis kualitatif dan kuantitatif obat atau metabolitnya ?

Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7,
intensitas fluoresensinya diukur pada λ eksitasi dan emisi
masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta
memberikan data sebagai berikut :
Konsentrasi (ng/mL)
10
20
40
Intensitas fluoresensi
20
42,5
85
Hitunglah konsentrasi obat (dalam ng/mL) dalam sampel
yang memiliki intensitas fluoresensi sebesar 64 !
HATUR NUHUN
PISAN ......
Jangan lupa
untuk membaca
literatur lainnya
baik dari buku
maupun internet
serta banyak
latihan soal ...
Kita BISA karena
BIASA ...

similar documents