材料與方法

Report
In vitro Antibacterial Activity of n-Hexane Fraction of Methanolic Extract of Alstonia scholaris L.
R.Br. Stem Bark against Some Multidrug Resistant Human Pathogenic Bacteria
黑板樹皮的甲醇萃取之正己烷分層
對人體抗藥性致病菌抗菌活性試驗
姓名:
學號:
授課教師:蔡銘祝
報告日期:2012年04月11日
目錄
 前言
 Alstonia scholaris L. R.Br. 黑板樹
 材料方法
-植物材料
-菌株
-萃取
-抗菌活性篩選
-藥敏試驗
-測定最低抑菌濃度測定(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)
-統計分析
 結果討論
-黑板樹皮提取物的體外抗菌活性
-黑板樹樹皮對菌株活性試驗
-不同菌株的抑製作用的百分比
-結論
 參考文獻
 備註
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前言
 新的疾病出現使病原菌和現有微生物突變導致人類發病和死亡的可能,
植物中的成份新的生物活性分子,針對病原體可作為自然療法,此外
成本高昂的傳統抗菌療法,特別是在亞洲和非洲國家也必須使用以植
物為基礎的自然醫學治療上。
 黑板樹屬(夾竹桃科)為印度次大陸和東南亞國家的長綠喬木,植物
不同部位已早被用來作為有效用的傳統藥用植物及藥材,替代藥用制
度尤納尼,順勢醫療法和悉得海(泰米爾語)類型的藥用延誤保障系統的
有力的植物藥。
 在本研究證實了生物活性中黑板樹樹皮甲醇萃取之正己烷分層物可抑
制對四種菌在對市面上抗生素的多重抗藥性之菌種。
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Alstonia scholaris L. R.Br.
黑板樹
黑板樹原產於印度、馬來西亞、菲律賓、爪哇等地,也是臺灣常見的綠化樹
種,然而因為它生長快速、材質鬆脆,颱風過後往往成為滿地折損的枝幹。
黑板樹每年10到11月左右會開出白色的小花,葉片及汁液具有輕微的毒性。
木材價格低廉,因此也被用來做為黑板或是木箱板等臨時性木材。
Kingdom Plantae 植物界
Phylum Magnoliophyta 木蘭植物門
Class Magnoliopsida 木蘭綱
Order Gentianales 龍膽目
Family Apocynaceae 夾竹桃科
Genus Alstonia 黑板樹屬
Alstonia scholaris (L.) R.Br. 黑板樹
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材料與方法 - 植物材料 (建議利用條列式或流程圖)
採用3.5歲 8 ft (2.44m)高黑板樹的莖部樹皮,2011年
Sonarpur Subhashgram,於南24 Parganas,印度西孟加拉邦。
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材料與方法 - 菌株 (建議利用條列式或流程圖)
 本研究中使用四種常見的人類病原菌

SN3b :大腸桿菌IK1_01
SN8a :陰溝腸桿菌
SN4a :志賀氏痢疾
SN8b :粘質沙雷氏菌
試驗進行菌株鑑定
使用伯傑的決定性細菌學手冊(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology )。
 MR(甲基紅試驗)、 V.P. (博赫斯 - Proskauer測試)、
TSI(三糖鐵瓊脂試驗)、測試的明膠、降解澱粉、吲哚製作、
檸檬酸、氧化酶和蠕動試驗。
 序列分析的16srDNA
 進化分析確認試驗,確認菌種。
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材料與方法 - 萃取 (建議利用條列式或流程圖)
1.
2.
先將樹皮切碎成片段後風乾在室溫(27-29°C)七天
,在用使用研磨機粉碎到粉末。
細粉末(40目尺寸)(1公斤)浸泡置甲醇中並在室溫下(26℃)為7天三次。
過濾紙過濾(使用 Whatman No. 1 濾紙),再以真空乾燥 40°C 成濃縮液。
 天然黑板樹樹皮之甲醇萃取的準備:
1. 懸浮於蒸餾水(100毫升)的原抽出物(125g)。
2. 正己烷(3x100ml)產量分別為100g。
3. 正己烷分層準備濃度為
0.05、0.1、0.25和0.5mg/ml 適量溶於殘留溶劑中。
4. 乾燥的萃取物在 -4℃ 冷藏,以備將來使用。
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材料與方法 – 藥敏試驗 (建議利用條列式或流程圖)
藥敏試驗於培養皿中進行 瓊脂擴散法
氨芐青黴素 ampicillin (10 μg) ;
氯黴素 chloramphenicol (30μg);
複方新諾明 co-trimoxazole (25μg); 紅黴素 erythromycin (15μg);
慶大霉素 gentamicin (10μg);
卡那黴素 kanamycin (30μg);
氟嗪酸 ofloxacin (5μg);
鏈黴素 streptomycin (10μg);
四環黴素 tetracycline (30μg);
萬古黴素 vancomycin (30μg).。
菌液在 37℃培養後獲得,
後再均勻塗抹 5 毫升 Mueller–Hinton 發酵液(MHB)(HIMEDIA)
擴散在Mueller-Hinton Agar(MHA)(HIMEDIA)4-5小時 。
在37ºC平板培養24小時,觀察抑制情形在對的抑制作用區測量直徑範圍。
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材料與方法 – 抗菌活性篩選
(建議利用條列式或流程圖)
 萃取物的抗菌活性測定瓊脂擴散法。
菌株生長在MHB震盪培養4小時,在經37℃狀態下的培養,
1 ml 培養液均塗抹在MHA培養基表面上,在使用無菌6mm的軟木
螟 鑽洞接種置MHA。
以200μl的植物提取物(正己烷懸浮液)填滿了及對照組(正己
烷)。
 濃度使用 10、25、50和100 mg/ml。
 四環素(150 μg /毫升,200μL)作為抑菌陽性對照組在
ATCC(American Type Culture Collection)株大腸桿菌ATCC25922使
用管制品。24小時後測量環直徑37℃培養
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材料與方法 – 最低抑菌、殺菌濃度測定
(建議利用條列式或流程圖)
測定最低抑菌濃度測定(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)
取發酵液稀釋法對萃取物進行了MIC和MBC
準備從24小時 MHB 培養基中培養接菌後和懸浮液濁度等值作出調整 0.5
麥氏標準。
懸浮液稀釋 1:10 MHB(無菌環境下)來取得後接種 5×105 CFU/ml。
以 96 孔盤消毒準備後配藥 180 μL 接種到每孔中的發酵液。
加入20 μL的植物萃取物等分。
植物萃取物測定
濃度為0.05、0.1、0.25和0.5 mg/ml。
四環素稀釋液作為陽性對照組,同時與20 μL正己烷養液作為陰性對照。
平板覆蓋並24小時在37℃溫育培養後,辨識最低抑菌濃度(MIC)
所有孔接種置培養基中恆溫培養。
 菌落形成單位(CFU,colony-forming unit)
 最小殺菌濃度(MBC)定義在CFU降低99.9%
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材料與方法 – 統計分析
 值表示為平均值 ±S.D. 有統計學意義
測定用 學生 t-檢驗。
 p值<0.05被認為意義。
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結果與討論 -黑板樹皮提取物的體外抗菌活性
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結果與討論 - 黑板樹樹皮對菌株活性試驗
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結果與討論 - 黑板樹樹皮對菌株活性試驗
a) E. bacterium IK1_01
c) E. cloacae
b) S. dysentery
d) S. marcescens
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結果與討論 - 不同菌株的抑製作用的百分比
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結果與討論 – 結論
 在這個實驗中使用的4個菌株,在一系列人類疾病,如皮膚感染,傷
口,胃腸道,尿道和呼吸道。
 而這些多重抗藥治病菌均顯著被甲醇萃取之正己烷分層物抑制,因此
這項研究結果,認同以植物傳統療法和替代使用對皮膚病,傷口,哮
喘,腹瀉,痢疾等消化道疾病及尿路感染。
 鼓勵使用天然產品,由於副作用較少或無副作用且成本低,並以合成
抗生素抗性發展。
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參考文獻
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Insecticidal, brine shrimp cytotoxicity, antifungal and nitric oxide free radical
scavenging activities of the aerial parts of Myrsine africana L. Afr. J. Biotech.,
10, 1448-1453.
 Ahmad I., Aqil, F. (2007). In vitro efficacy of bioactive extracts of 15 medicinal
plants against ESβL-producing multidrug-resistant enteric bacteria. Microbiol.
Res., 162, 264-275.
 Ahmad, I., Beg, A.Z. (2001). Antimicrobial and phytochemical studies on 45
Indian medicinal plants against multi-drug resistant human pathogens. J.
Ethnopharmacol., 74, 113- 123.
 Akhtar, A., Rahman, M.S., Ahsan, M. (2008). Preliminary Antimicrobial and
Cytotoxic Activities of n-Hexane Extract of Jatropha pandurifolia. Lat. Am. J.
Pharm., 27, 918- 921.
Etc.
17
-THE END 謝謝指教
18
備註 - E. cloacae
腸桿菌
 腸桿菌, 特別是陰溝腸桿菌是很重要的醫院病原體負責各種感染,其
中包括菌血症, 下呼吸道感染, 皮膚及軟組織的感染, 尿路感染
(UTIs), 心內膜炎, 腹腔內感染, 化膿性關節炎, 骨髓炎,眼部
感染。
 這也導致各種區域性獲得感染,包括尿路感染,皮膚和軟組織感染,
傷口感染,等等。
2012/04/11
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備註 : S. Dysentery
志賀氏痢疾
 志賀氏痢疾是革蘭氏陰性菌非孢子成形兼性厭氧,非主動行細
菌,由污染的水與食物傳播,因為其強大的和致命的志賀毒素
導致的最嚴重的細菌性痢疾。
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備註 : S. Marcescens
粘質沙雷氏菌
 粘質沙雷氏菌是革蘭氏陰性的物種,桿狀細菌在家族腸桿菌。
 參與粘質沙雷氏菌院內感染,尤其是導管關聯的性菌血症,尿
路感染和傷口感染。通常發現在住院的成人的呼吸道和泌尿道
和在兒童的胃腸道系統。
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備註 : 軟木螟
 軟木螟,可切割了一個洞,在軟木或橡膠瓶塞插入玻璃管的金屬工具。
軟木螟是一個空心管,錐形邊緣,一般在另一端的一些手柄。
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備註:n-Hexane
正己烷
 己烷,化學式C6H14,是烷烴中的第六個成員。
 己烷是常用的非極性具汽油味的有機溶劑,被廣泛應用於色譜
法中。
 正己烷作為良好的有機溶劑,被廣泛使用在化工有機合成,機
械設備表面清洗去污等環節。但其具有一定的毒性,會通過呼
吸道、皮膚等途徑進入人體,長期接觸可導致人體出現頭痛、
頭暈、乏力、四肢麻木等慢性中毒癥狀,嚴重的可導致暈倒、
神志喪失、甚至死亡。
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備註: 16S ribosomal rDNA
什麼是16S rRNA基因,
16S rRNA基因的部分是 所有的細菌和古細菌中發現原核生物的DNA。
rRNA基因,並反過來這個rRNA基因編碼核糖體的一部分。在rRNA基因
的第一個“R”代表核糖體。核糖體的兩個亞基,大亞基(路易斯安那州立
大學)和小亞基(SSU)組成。這兩個亞基的mRNA的核糖體的翻譯,因
為它通過飼料三明治。雖然也有幫助,以彌補一般核糖體的功能單位,相
關蛋白,在細菌中,在SSU編碼的16S rRNA基因,
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備註 : McFarland standard
 麥氏標準作為參考來調整菌懸液的濁度,使細菌的數量將是一
個給定的範圍內使用。
麥氏濁度儀標準
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