시스템 생물학과 4학년 정승연 Mass Spectrometry

Report
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생물리학 발표 PPT
Mass Spectrometry
시스템 생물학과 4학년 정승연
시스템 생물학과 4학년 정승연
Quattro microTM LC-MS/MS system
GCT Premier GC/MS
LCT Mass Spectrometer
Thermo Finnigan Trace GC/MS
http://www.ucd.ie/cscb/main_pages/facilities/mass_spectrometry.htm
Mass Spectrometer
MALDI ToF
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Thermal_ionization_mass_spectrometer.jpg
http://www.ucd.ie/cscb/main_pages/facilities/mass_spectrometry.htm
Thermal ionization MS
이 기계는 초전도 자석 내에서
이온의 회전 주파수를 측정해
분자무게를 측정하는 장비로,
http://blog.daum.net/obk2030/16514054
가장 가벼운 분자인 수소분자의
100만분 1의 무게 차이도 정확
히 측정할 수 있는 초정밀 장비
입니다.
한국기초과학지원연구원 – 15T FT-ICR MS’
Mass Spectrometry란
•
MS, 질량분석법
•
전체 질량의 0.01%, Small organic molecule의 500만분의 1에 달하는 정확도
•
매우 높은 민감도
•
다양한 물질에 사용가능
–Proteins
–Oligonucleotides
–Oligosaccharides
–Lipids
–Others
•
Proteomics 에 활용
* 단점 : 고가, 고 진공, 고전압, 높은 유지비 등이 있음
Mass Spectrometry의 과정
• 주입 시스템 : 먼저 시료를 도입한다.
• 이온 발생원(Ionization source) : 시료분자의 이온화, 더 작은 이온으로 쪼갬
• 질량 분리기(Mass analyzer) : 이온을 질량 대 전하 비로 선택적 분리
• 검출기(Detector) : 이온 흐름을 그 양에 비례하는 전기적 흐름으로 전환, 증폭
시켜 signal을 생성
Mass Spectrometry의 과정
Q. 분석하려는 시료를 이온화를 하는가 ?
Q. 진공시스템은 왜 필요한가 ?
MS 분류하기
Ion source
1. Electrospray
Ionization(ESI) 액체
Mass
 Selection
–Atmospheric Pressure Ionization (APCI)
–Chemical Ionization (CI)
–Electronic Ionization (EI)
2. Matrix Assisted Laser
DesorptionIonization
(MALDI)
고체
Detector
3. Time of Flight(TOF)
4. Quadrupole
–Magnetic Sector
–Ion Trap
–Ion Cyclotron
–Phosphor / Photo Diode
5. Multi-channel Plate
(MCP)
Ionization의 종류
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=777579&cid=559&categoryId=559
Ion source : ESI
분자량이 10만 이상인 폴리펩티트, 단백질, oligonucleotide
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_esi.html
• 1984
•포름산 같은 산성 용액 사용
•(+)charge의 반발력 사용
보통 MS는 m/z가 1,500 이하
인 곳에서 분해능이 뛰어나다.
ESI 방법을 사용하면 전하가 +2,
+3, +4 등 전하가 높기 때문에
충분히 m/z가 1,500이하로 떨어
져 분석할 수 있게 된다. ESI는
HPLC를 사용하여 직접 시료를
도입할 수 있는 장점이 있다.
ESI의 특징
• 전자 분사 이온화
• 액체 상태의 시료를 이온화(LC-MS)
• 기존의 방법으로는 얻기 힘들었던 intact 상
태의 peptide나 단백질을 이온화
• 한 개 이상의 전하를 띤 이온을 생성
Ion source : MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionizatio
n_maldi.html
• 분자량이 수천에서 수만에 이르는
극성 생화학 고분자 화합물
•1988년 독일과 일본
•MALDI 법은 매트릭스 물질과 분석
시료를 섞어 스테인리스 강 탐침 끝
에 바른다.
• 매트릭스는 레이저를 강하게 흡수
하며 그 후에 매트릭스와 분석물은
탈착되어 이온화된다.
•MALDI 법은 분석기로 비행 시간
(TOF)를 사용한다.
Ion source : MALDI
Laser
Sample
support
+
m m a+
m a
a
m+ m m
+
a m a
m +
a
m m
1. Matrix와 sample을 약
1000~10000:1로 섞어서 적당한
유기 용매에 혼합
matrix +
analyte
2. 혼합물을 시료용 plate에 올려놓고
진공 조건 만들어주면 유기 용매
는 기화되고 시료는 matrix와 함께
균질하게 결정화 된다.
3. 이 때 laser조사하면 에너지가
matrix를 통해 sample로 전달되어
약한 이온화가 일어난다.
4. 전기장을 사용해서 이온들을 모으
고 m/z에 따라 나누어 분석한다.
Laser
Sample plate
hn
1. Sample (A) is mixed
with excess matrix (M)
and dried
on a MALDI plate.
2. Laser flash ionizes
matrix molecules.
AH+
3. Sample molecules are
ionized by proton
transfer from matrix:
MH+ + A  M + AH+.
+20 kV
Variable Ground
Grid
Grid
The Mass Analyzer: TOF
Time Of Flight(TOF)
Ion Source
20-25 kV
Flight Tube
+ +
The Mass Analyzer: TOF
Ion Source
Flight Tube
+
Detector
+
+
The Mass Analyzer: TOF
Ion Source
Flight Tube
+
+
Detector
+
MALDI ion
source
Ion
detector
The reflector focuses ion of same
mass but different velocity on
detector; high resolution is obtained
Ion reflector
HiRes mass spectrum
MALDI TOF의 특징
• 큰 분자량 물질을 분석 가능 (>400kDa)
• 혼합물 분석 가능
• 미량 분석 가능(펩타이드의 경우 fmol 분
석 가능)
• 데이터 분석 용이
• 염의 영향 덜 받음
• 비용 저렴, 빠른 시간 내에 가능
• 높은 throughput (>1000 sample/hour)
MALDI/TOF Mass spectrum
Calibration of the mass scale
The mass-to-charge ratio of an ion is proportional to the
square of its time of flight in the analyzer (“drift time”).
2
m 2t K
 2
z
L
The Mass Analyzer: Quadrupole
The Mass Analyzer: Quadrupole
The Mass Analyzer: Quadrupole
Quadrupole(Mass filter)
- 4개의 금속 막대로 이루어져 있으며, 한쌍(1,2)은 DC
voltage, 다른 한 쌍(3,4)은 Radio frequency voltage가 가해
진다.
- Quadrupole의 막대는 각각 (+)와 (-)의 서로 반대되는 전하
를 가진다.
- 가해지는 전압의 진폭은 선택된 m/z에 해당되는 ion만 ion
source에서 detector까지 통과하게 한다.
- Quadropole의 전압을 바꾸면서 주어진 mass범위의 이온을
scanning 한다.
Detectors : MCP
MCP: Multiple-channel plate
Ions are detected with a Microchannel Plate
처음 들어온 primary
incident particle이 surface
를 치거나, some material을
통과하게 되면 secondary
particle의 방출이 유도된다.
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
+
Primary Ion from
Flight Tube
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
+
D= 6-25 u
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
Multification by secondary emission
+
e-
Secondary emissive materials:
Beryllium oxide, magnesium oxide etc
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
ee- e-
+
e-
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
ee- e-
+
e-
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-100 V
D= 6-25 u
eee-
e-
e- e-
e-
eee- e
e-
+
Secondary particle이 여기서와
같은 electron일 때 이것을
secondary electron emission
이라고 한다.
-1000 V
~103
Amplification
L
Tandem MS(MS/MS)
MS/MS : MS를 두 번 사용하는 방법
Tandem MS(MS/MS)
MS/MS : MS를 두 번 사용하는 방법
CID : collision induce dissociation – 1차적으로 생성된 이온이 collision cell
에서 가스 분자와 충돌하면 fragmentation이 발생한다.
Peptide Mass Fingerprinting
• 단백질을 sequencing하는 분석 방법
• Protease를 사용하여 peptide를 잘게 쪼갠다.
• 절단 후 발생하는 단편들을 질량 분석을 통하
여 분석한다.
• Mass measured with MALDI-TOF
and ESI-TOF
Peptide Mass Fingerprinting
• 분석 가능 장비 : Q-TOF, MALDI-TOF, ESI MS
Peptide Mass Fingerprinting
Peptide Mass Fingerprinting
Thank you!!
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