PTC - SSCP

Report
Licenciatura em Ciências da Saúde
Genética Humana
3º Ano – 1º Semestre
2012-2013
2º Trabalho Laboratorial
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA SENSIBILIDADE AO PTC (feniltiocarbamida)
1. Registo da sensibilidade ao PTC
2. Extracção de DNA genómico a partir de epitélio bucal e sua caracterização
3. Detecção do polimorfismo TAS2R38 por PCR-RFLP
a. Amplificação por PCR da região genómica de interesse
b. Hidrólise do produto de PCR com enzima de restrição
c. Avaliação dos resultados por electroforese em gel de agarose
4. Rastreio de polimorfismos por SSCP
5. Interpretação e integração dos resultados
SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM
SSCP
A mobilidade electroforética de uma molécula de DNA
em cadeia simples num gel desnaturante é função da sua
sequência nucleotídica e do seu comprimento.
Ambos os parâmetros determinam a forma, o tamanho
efectivo e a densidade de carga superficial da molécula de
DNA.
Assim, torna-se possível distinguir cadeias simples que
diferem entre si por apenas um nucleótido
Coloração do gel de
poliacrilamida com nitrato de prata
sensibilidade superior ao brometo de etídio
(1 pg versus 1 ng)
Cadeias simples
Cadeias duplas
COLORAÇÃO COM NITRATO DE PRATA
Os geis de poliacrilamida são impregnados com ião
prata solúvel (Ag+) e revelados por tratamento com
um agente redutor.
As macromoléculas no gel promovem a redução do
ião prata a prata metálica (Ag0), a qual é insolúvel e
visível, permitindo a visualização de ácidos nucleicos
e proteínas contidos nas bandas.
A deposição inicial de prata metálica promove a
deposição posterior de mais prata metálica, num
processo autocatalítico de que resulta uma elevada
sensibilidade.
Fixação – tratamento com ácido acético que torna as
moléculas insolúveis e impedem a sua difusão para fora
do gel durante os passos seguintes.
Substâncias que podem interferir com processo de
coloração (tampões, iões, desnaturantes, detergentes,
anfólitos) são também removidas neste passo.
Impregnação com prata – o gel é tratado com nitrato
de prata. As condições moderadamente acídicas evitam
que o ião Ag seja reduzido a Ag metálica. O gel é lavado
com água para remover o excesso de prata da
superfície do gel.
Revelação – a solução contém formaldeído que reduz o
ião prata a prata metálica. Esta reacção só tem lugar a
pH elevado, que é dado pelo bicarbonato de sódio.
O tiossulfato de sódio fornece o ião sulfureto (S2-) que
reage directamente com a Ag, acelerando e
desenvolvendo o processo. O tiossulfato forma
também um complexo com o ião Ag livre evitando a
sua redução a Ag metálica, o que reduz o
“background”.
Paragem e preservação – esta solução evita a
continuação da redução do ião prata. Além disso
contém glicerol que evita que o gel se quebre durante
o processo de secagem.
RASTREIO DE MUTAÇÕES
Métodos que localizam a zona do gene onde se situa a
mutação. Evita a sequenciação de grandes porções de
um gene de modo a identificar uma mutação
RASTREIO DE MUTAÇÕES
Situações em que se usam estes métodos:
 Gene isolado e sequenciado, mas poucas mutações
identificadas
 Gene com elevada frequência de alguns alelos
mutados, mas nenhum deles foi detectado no doente
através de métodos directos
 Gene com muitos alelos mutados conhecidos, mas
todos apresentando uma baixa frequência

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