ECOLOGÍA MICROBIANA - Flor García Huamán

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• Análisis de comunidades microbianas basadas en
técnicas de cultivo.
• Análisis molecular de las comunidades microbianas.
• Medición de la actividad microbiana en la
naturaleza.
Dra. Flor Teresa García Huamán
1
La ecología microbiana trata de la interacción de los
microorganismos
entre
sí
y
su
ambiente.
Los ecólogos microbianos se dedican principalmente a dos
áreas de estudio.
La bidiversidad
• Qué incluye el aislamiento, identificación y cuantificación
de microorganismos en hábitats diversos.
La actividad microbiana
• Es decir, lo que los microorganismos hacen en sus
hábitats.
Dra. Flor Teresa García Huamán
2
La ecología microbiana tiene dos grandes objetivos:
• Apreciar la biodiversidad de los microorganismos
y entender la interacción entre los diferentes
grupos que componen la comunidad.
• Medir la actividad de los microorganismos en la
naturaleza y controlar sus efectos en el
ecosistema.
Dra. Flor Teresa García Huamán
3
Este proceso consiste en separar los organismos de
interés de una comunidad microbiana, un
procedimiento
que
se
conoce
como
ENRIQUECIMIENTO, y que permite aislarlos después en
un cultivo axénico. El aislamiento es importante por
que se obtienen cultivos para estudios detallados y
controlados de laboratorio y para su aplicación en
biotecnología y microbiología ambiental e industrial.
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4
En un ambiente natural no es frecuente encontrar un solo tipo
de microorganismo. Lo que existe son comunidades microbianas,
y el desarrollo de métodos y procedimientos que permitan el
aislamiento y cultivo de microorganismos interés es un reto para
el ecólogo microbiano.
El enfoque más corriente para alcanzar este propósito es la
TECNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO.
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TÉCNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO
Este método requiere que el medio de cultivo y las condiciones
de incubación sean selectivos para el organismo que se desea
aislar y contra selectivos para los organismos no deseados.
Por tanto se necesita reproducir lo más fielmente posible los
recursos y las condiciones que se dan en este nicho ecológico y
buscar luego los habitantes potenciales de aquel hábitat
capaces de desarrollarse en las condiciones de enriquecimiento
seleccionadas.
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Para que un cultivo de enriquecimiento tenga éxito es
necesario contar con un inóculo apropiado (una
muestra que contenga el microorganismo). Por tanto, la
metodología del cultivo de enriquecimiento se inicia
con la elección del hábitat adecuado.
El cultivo de enriquecimiento suele establecerse
sembrando el inóculo directamente en un medio
altamente selectivo; muchos de los procariotas más
frecuentes pueden aislarse de esta manera.
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Por ejemplo, el microbiólogo holándes Martinus Beijerink, a
quien se deben las primeras técnicas de cultivo de
enriquecimiento, aisló por primera vez la bacteria fijadora de
nitrógeno Azotobacter por medio de lo que después se
convirtió en una estrategia clásica de enriquecimiento.
Como Azotobacter puede crecer rápidamente fijando N2 del aire,
los medios de enriquecimiento carentes de amoniaco u otras
formas de nitrógeno fijado son muy selectivos para este
organismo; las bacterias no fijadoras de nitrógeno o las bacterias
fijadoras de nitrógeno anaeróbicas son contra seleccionadas con
este método.
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Tanto el medio de cultivo como las condiciones de
incubación son críticos para que tenga éxito un cultivo
de enriquecimiento; es decir deben optimizarse tanto
los recursos como las condiciones para tener las
mejores posibilidades de enriquecer el microorganismo
que interesa.
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Tradicionalmente, la columna de Winogradsky se ha utilizado en
el cultivo de enriquecimiento para el aislamiento de bacterias
fototróficas rojas y verdes, de bacterias sulfatoreductoras y de
muchos otros anaerobios.
El nombre corresponde al famoso microbiólogo ruso Sergei
Winogradsky, quien utilizó la columna por primera vez a finales
del siglo XIX para estudiar microorganismos del suelo.
La columna de Winogradsky es un ecosistema anóxico en
miniatura, que puede usarse como suministro a largo plazo de
bacterias para cultivos de enriquecimiento.
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La columna de Winogradsky se prepara con un cilindro de vidrio
grande que se llena aproximadamente hasta la mitad con lodo
rico en materia orgánica, y que preferiblemente contenga
sulfuro.
Los sustratos de carbono se mezclan previamente con el lodo;
éstos determinarán que organismos serán enriquecidos, pero
deben evitarse los sustratos fácilmente fermentables (que
pueden llevar a una formación excesiva de gas). Al lodo se le
añade CaCO3 y CaSO4 como tampón y como fuente de sulfato
respectivamente.
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El lodo se compacta en el envase, cuidando de no atrapar aire.
El lodo se cubre con agua de un lago, embalse o acequia (o
agua de mar si se prepara una columna marina), y se tapa el
cilindro para evitar la evaporación. Se coloca el cilindro cerca
de una ventana donde reciba luz solar atenuada y se deja
durante varias semanas.
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En una columna de Winogradsky típica se desarrolla una mezcla de
organismos.
Las algas y cianobacterias ocupan rápidamente la parte superior y al
producir O2 ayudan a mantener esta zona óxica.
El proceso de descomposición en el sedimento lleva rápidamente a
la producción de ácidos orgánicos, alcoholes y H2, sustratos
adecuados para las bacterias sulfato reductoras.
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El sulfuro producido por las bacterias sulfato reductoras
provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del
azufre.
Estos organismos aparecen generalmente como zonas
de crecimiento en el lodo de la columna, pero también
pueden desarrollarse profusamente en el agua si los
fotótrofos oxigénicos son escasos.
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Para el muestreo de bacterias fototróficas de la columna se
introduce una pipeta larga con la que se recoge un poco de lodo
o agua coloreada. Estas muestras se pueden usar para
microscopía y para inocular medios de enriquecimiento para
aislamiento y caracterización.
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SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO
Aunque el cultivo de enriquecimiento es una herramienta
poderosa, en muchos casos se produce un sesgo en el
enriquecimiento.
En los cultivos líquidos de enriquecimiento típicos, el organismo
más adaptado a las condiciones escogidas puede convertirse en
la población dominante.
Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos
de laboratorio a menudo es sólo un componente minoritario del
ecosistema microbiano, en lugar de ser el mayoritario o el más
relevante desde el punto de vista ecológico.
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El sesgo en el enriquecimiento puede demostrarse cuando
se comparan los métodos de dilución con el clásico
enriquecimiento en líquido.
La dilución del inóculo seguida de un enriquecimiento a
menudo da lugar a un organismo diferente que cuando se
enriquece un inóculo sin diluir.
Se cree que la dilución elimina aquellas poblaciones
minoritarias pero de rápido crecimiento, dando de este
modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de
la comunidad. Por tanto, la dilución del inóculo es una
práctica común en el cultivo de enriquecimiento en la
microbiología actual.
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Los cultivos axénicos (o puros) se pueden obtener de
muchas maneras a partir de un enriquecimiento; los
métodos empleados más frecuentes son la siembra
por estría en superficie (en placa petri), la siembra en
profundidad (agar shake) y la dilución en líquido. Para
aquellos microorganismos que crecen bien en medio de
cultivo sólido (con agar), el método de elección es la
siembra por estría.
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A partir de una población mixta, mediante la siembra
por estría se obtienen colonias separadas; repitiendo
esta técnica con una de estas colonias aisladas se
consigue un cultivo axénico, que puede ser transferido
a un medio líquido.
Las placas sembradas de este modo e incubadas en las
condiciones adecuadas (por ejemplo en una jarra
anóxica para anaerobios) nos permiten aislar tanto
microorganismos aerobios como anaerobios.
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SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Y NÚMERO MÁS PROBABLE
El método de siembra en profundidad consiste en la dilución de
un cultivo mixto en tubos de agar fundido; cuando el agar
solidifica, las colonias se desarrollan embebidas en el tubo de
agar en vez de en la superficie, como ocurre en la siembra por
estría en placa.
Es un método de gran utilidad para purificar determinados tipos
de microorganismos anaerobios, por ejemplo, las bacterias
fototróficas del azufre y sulfato reductoras de las columnas de
Winogradsky.
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Es posible obtener cultivos axénicos mediante
diluciones sucesivas de una suspensión de células en
tubos de agar fundido. A partir de una colonia crecida
en el tubo de mayor dilución utilizada como inóculo, se
puede volver a hacer otro banco de diluciones, de tal
manera que se acabe obteniendo un cultivo axénico.
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Un procedimiento similar sin usar agar es la dilución seriada de
un inóculo en un medio líquido hasta que el tubo o tubos finales
de la serie no muestran crecimiento.
Utilizando diluciones seriadas de diez en diez, por ejemplo, el
último tubo que muestre crecimiento tiene que haberse
originado a partir de 10 células o menos. Si se repite varias veces
este proceso se obtienen cultivos axénicos. Esta técnica se
conoce como la Técnica del Número Más Probable (NMP).
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La Técnica del NMP se usa para estimar el número de
microorganismos en alimentos, aguas residuales y en otras
muestras donde hay que evaluar rutinariamente el número de
células. Se puede hacer con medios altamente selectivos y
condiciones de incubación dirigidos a uno o a un pequeño grupo
de organismos, como por ejemplo un determinado patógeno, o
usando un medio complejo para obtener una estimación del
número total de células.
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Con independencia del método utilizado para purificar
el cultivo, una vez obtenido un supuesto cultivo axénico
es esencial comprobar su pureza. Se utiliza para ello
una combinación de técnicas microscópicas,
observación de las características de la colonia en
placas, o en siembras en profundidad en tubo, y
comprobación del crecimiento en medios donde el
microorganismo que nos interesa aislar crece muy
poco, pero que favorecen el crecimiento de los
microorganismos acompañantes.
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La observación microscópica de un solo tipo
morfológico de célula, junto con unas características
uniformes de la colonia y ausencia de contaminación
en test con diversos medios de cultivo, puede tomarse
como prueba de que un cultivo es axénico (puro).
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CULTIVOS AXÉNICOS DE ALTA TECNOLOGÍA: LAS PINZAS DE LÁSER
Además de los métodos clásicos descritos, los avances
tecnológicos han permitido la utilización de nuevas herramientas
para la obtención de cultivos axénicos; una de ellas son las pinzas
(ópticas) de láser.
Las pinzas de láser consisten en un microscopio óptico invertido
equipado con un laser infrarrojo enfocado con precisión y un
instrumento de micro manipulación.
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Una célula individual del campo de visión es atrapada por el haz
de rayos laser y separada del resto de microorganismos. La célula
queda atrapada por que la fuerza creada por el láser que empuja
hacia abajo los objetos pequeños (como las células microbianas)
y los mantiene en el lugar; cuando el haz de láser se desplaza, las
células atrapadas se mueven junto con él. Si la muestra está en
un tubo capilar, se atrapa una única célula que después se aísla
rompiendo el tubo en un punto entre la célula y el resto de la
población.
La célula recogida se introduce entonces en un tubo pequeño de
medio estéril para iniciar su crecimiento como cultivo axénico.
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La tecnología de pinzas de láser es especialmente útil para el
aislamiento de bacterias de desarrollo lento, que pueden ser
superadas por el desarrollo rápido de otras poblaciones en los
cultivos de enriquecimiento típicos, o para los organismos
presentes en números tan bajos que podrían perderse con los
métodos de enriquecimiento a partir de la dilución. Y junto con
el uso de tinciones específicas capaces de identificar organismos
determinados en un campo del microscopio, las pinzas de láser
se emplean para seleccionar organismos a partir de una mezcla
para su purificación y posterior estudio en el laboratorio.
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A.- VIABILIDAD Y CUANTIFICACIÓN MEDIANTE TÉCNICAS
DE TINCIÓN
B.- TINCIONES GENÉTICAS
C.- PCR: RELACIONANDO GENES ESPECÍFICOS CON
ORGANISMOS ESPECÍFICOS.
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A.- VIABILIDAD Y CUANTIFICACIÓN MEDIANTE TÉCNICAS DE TINCIÓN
1.
2.
3.
4.
Tinción Fluorescente con DAPI.
Tinción de viables.
Anticuerpos fluorescentes.
Proteína fluorescente verde para el etiquetado celular.
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1.-Tinción Fluorescente con DAPI:
Las tinciones fluorescentes se han usado mucho para teñir
microorganismos en hábitats opacos. El colorante DAPI (4’,6diamido-2-fenilindo) se utiliza con frecuencia para este
propósito; las células teñidas con DAPI presentan fluorescencia
azul brillante y son muy fáciles de ver y enumerar. La tinción
DAPI se emplea para la enumeración de microorganismos en
muestras clínicas, del ambiente y de alimentos.
Dependiendo de la muestra, la tinción con colorantes
fluorescentes no específicos puede representar un problema,
pero el DAPI, que tiñe ácidos nucleicos, no suele reaccionar con
la materia inerte.
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Por tanto, para muchas muestras de suelo y agua, la tinción DAPI
proporciona una estimación razonable del número de células
presente. Para muestras acuáticas, las células se tiñen en la
superficie de un filtro después de haber filtrado un volumen
determinado de líquido. Estas técnicas sencillas tienen la ventaja
de no ser específicas (tiñen todos los microorganismos de una
muestra), pero con el inconveniente de que no diferencian entre
células vivas y muertas, ni permiten el rastreo de organismos
específicos en el ambiente.
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2.-Tinción de viables :
Se ha desarrollado una tinción con colorantes fluorescentes que
diferencia entre células vivas y muertas. Esto proporciona
información no sólo del número de organismos de una muestra
sino también de su viabilidad. Esta distinción se basa en la
integridad de la membrana citoplasmática celular.
A la muestra se añaden dos colorantes, verde y rojo; el colorante
fluorescente verde penetra en todas las células, viables o no,
mientras que el rojo, que contiene yoduro de propidio, penetra
sólo en aquellas células cuya membrana ya no se encuentra
intacta y por tanto, están muertas.
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Las células verdes estaban vivas y las rojas muertas, lo
que ofrece una evaluación instantánea de la viabilidad.
Este método se utiliza con cultivos bacterianos de
laboratorio, pero no es adecuado para el examen
microscópico de hábitats naturales
debido a
problemas de tinción inespecífica de los materiales
inertes.
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3.-Anticuerpos Fluorescentes:
Las técnicas de tinción con sustancias fluorescentes pueden
hacerse más específicas con el empleo de anticuerpos
fluorescentes.
La gran especificidad de los anticuerpos frente a los
constituyentes de la superficie de un organismo particular puede
explotarse para identificar o rastrear un organismo en un hábitat
complejo; por ejemplo, suelo o una muestra clínica que contenga
una mezcla de muchos organismos.
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El método requiere la preparación de anticuerpos específicos
contra los organismos que interesan, lo cual es largo y laborioso.
Sin embargo, para el caso de microorganismos de importancia
clínica, se dispone comercialmente de anticuerpos de alta
especificidad.
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4.-Proteína Fluorescente Verde para el Etiquetado Celular:
En el genoma bacteriano se puede insertar un gen que codifica
una proteína fluorescente verde (GFP, green fluorecens protein).
Al expresarse, las células que contienen la GFP aparecen de color
verde cuando se observan con un microscopio de luz
ultravioleta.
Aunque no resulta útil para el estudio de poblaciones naturales
(por que estas células carecen del gen GFP), las células
etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las
raíces de las plantas y seguir con el microscopio la cepa
etiquetada.
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Con este método los ecólogos microbianos pueden estudiar in
situ la competencia microbiana entre la microbiota nativa y la
cepa con GFP introducida o evaluar el efecto de la perturbación
en el ambiente.
La GFP también se ha usado ampliamente en cultivos de
laboratorio como gen “indicador”.
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B.- TINCIONES GENÉTICAS
1.- TINCIÓN FILOGENÉTICA CON HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE
IN SUTU (FISH, fluorescen in situ hybridization).
2.- TINCIÓN DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCIÓN INVERSA IN
SITU.
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1.-TINCIÓN FILOGENÉTICA CON HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SUTU :
Los colorantes filogenéticos son oligonucleotidos fluorescentes
complementarios en la secuencia de base a las secuencias en el
ARNr 16s o 18s. Los colorantes filogenéticos penetran en la
célula, donde hibridan con el ARNr directamente en los
ribosomas.
Como se han identificado sondas filogenéticas para especies
microbianas individuales, así como para dominios enteros de
organismos, el grado de especificidad de un colorante
filogenético puede controlarse mediante la secuencia de la
sonda fusionada. La FISH permite identificar o rastrear un
organismo particular o un grupo de organismos relacionados,
dependiendo de la especificidad de la sonda.
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2.-TINCIÓN DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCIÓN INVERSA IN SUTU:
La tinción de cromosomas se emplea para identificar genes
específicos de la microbiota de muestras naturales, mientras que
la transcripción se dirige a un ARNm específico (es decir genes
expresados).
La tinción de cromosomas se inicia con el marcado fluorescente
de una sonda de oligonucleótidos o del gen completo, de un
conjunto de genes, o incluso de un genoma completo digerido
para obtener sondas pequeñas. Las sondas se utilizan para
averiguar que organismo(s) de una muestra contiene(n) el gen o
los genes presentes en las sonda(s).
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La tinción de cromosomas es útil para identificar bacterias que
contienen genes específicos, como los que codifican la
nitrogenasa (responsable de la fijación del nitrógeno), los
componentes del centro de reacción fotosintético, o vías
autotróficas específicas.
Los números de células fluorescentes en cada caso darían una
estimación de las bacterias fijadoras de nitrógeno, fotótrofas o
autótrofas, respectivamente, en una muestra natural.
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A diferencia de la técnica anterior, la transcripción inversa in situ,
busca si un organismo está expresando un gen o genes
determinados en la naturaleza en un momento determinado.
El método utiliza una sonda que hibrida con un ARNm específico
previamente transcrito por las células en una muestra.
Una vez que la sonda reacciona, tiene lugar la transcripción
inversa, produciendo un ADN complementario que es
amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Finalmente, el ADN amplificado reacciona con una sonda
fluorescente.
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C.- PCR: RELACIONANDO GENES ESPECÍFICOS CON ORGANISMOS ESPECÍFICOS.
Muchos estudios en ecología microbiana no necesitan
aislar los microorganismos, ni siquiera identificarlos por
microscopía con las tinciones antes descritas.
Generalmente, el objetivo de un estudio es evaluar la
biodiversidad de un hábitat sin emplear técnicas de
cultivo, ni observar células. Con este objetivo, se han
aislado y caracterizado genes específicos como medida de
la biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los
genes específicos están ligados frecuentemente a
organismos específicos la detección del gen implica la
presencia del organismo.
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Las principales técnicas en este tipo de análisis
microbiano son:
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y análisis de la comunidad
microbiana.
Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE): Separación
de genes similares.
Clonación molecular
Secuenciación y análisis de ADN
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Cualquier medición de la actividad microbiana (reducción de
sulfato, fotosíntesis, respiración etc.) en una muestra natural es
una estimación colectiva del conjunto de la comunidad
microbiana.
• Radioisótopos
• Microelectrodos
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• Isótopos estables
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