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ANALYSE DER INOSIN-5'-MONOPHOSPHATDEHYDROGENASE-AKTIVITÄT UND DER IMPDH1GENEXPRESSION IN DEN LYMPHOZYTEN VON
MYCOPHENOLAT-MOFETIL-BEHANDELTEN
NIERENPATIENTEN
6. November 2013
Masterseminar – Marc Müller
Inhalt
2
1
2
3
Grundlagen
1.1
Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
1.2
Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
1.4
GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen
Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)
2.1
IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente
2.2
Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
1 Grundlagen
3
1.1
Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
Quelle: http://www.jameda.de/gesundheits-lexikon/bilder/
1 Grundlagen
4
1.1
Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
Lokalisierung und Besonderheiten:

Knapp unterhalb der Rippenbögen in Höhe des 12. Brustwirbels jeweils rechts und links

Neben der Lunge einziges Organ in doppelter Ausführung

Form einer Bohne mit Einbuchtung in der Mitte
Einmündung der Nierenarterie
Ausmündung der Nierenvene, Lymphgefäße und Harnleiter
physiologische Hauptaufgaben:
Reinigung des Blutes von harnpflichtigen Substanzen: Harnsäure, Harnstoff, toxische Metabolite
(= glomeruläre Filtration)
Regulation des Wasserhaushalts ↔ Blutdruck
Regulation der Elektrolytkonzentrationen
Gluconeogenese
Hormonsynthese → u.a. Erythropoetin, Renin und Calcitriol (Vitamin D)
1 Grundlagen
5
1.2
Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
Exemplarische Nephropathien

diabetische Nephropathie als Folge von Typ I und II - Diabtetes

Glomerulonephritiden / Glomerulopathie (Autoimmunentzündung der Nieren)

Tubulointerstitielle Nierenerkrankungen (bakteriell, viral oder toxisch)

Fehlbildungen der Nierengefäße

Tumore (Nierenzellkrazinom oder Onkozytom)

…
Datenquelle:
1 Grundlagen
6
1.2

Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
Inzidenz:
210 neue Dialysepatienten pro 1 Million Einwohner ( ≈ 16900 bezogen auf deutsche
Gesamtbevölkerung)
GFR = glomeruläre Filtrationsrate

Häufigkeit einer starken Niereninsuffizienz (Stufe 5):


0,13 % der deutschen Gesamtbevölkerung
einer von 1000 Bürgern
Datenquelle:
1 Grundlagen
7
1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Dialyse / Blutwäsche
Nierentransplantation
Quelle: Fresenius Medical Care AG
1 Grundlagen
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1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Nierentransplantation
Problematik:



Potenzielle Transplantatabstoßung! → induziert durch Immunantwort beim Transplantat-Empfänger
Gefahr des Misserfolgs der Nierenersatztherapie
Potentielle Lebensgefährdung für den Transplantat-Empfänger
Lösung:
Rejektionsprophylaxe durch eine immunsuppressive medikamentöse Therapie
→ gezielte Down-Regulation des Immunsystems des Transplantat-Empfängers
1 Grundlagen
9
1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
Azathioprin
 Prodrug → Thiopurinmethyltransferase (TPMT) metabolisiert
diese zu 6-Mercaptopurin
 6-Mercaptopurin interferiert als atypisches Nukleosid mit der
DNA-/RNA-Synthese
 Inhibierung der Proliferation von B- und T-Lymphozyten
1 Grundlagen
10
1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
Calcineurin-Inhibitoren
 z.B. Ciclosporin
 Hemmung der Phosphatase Calcineurin
 dephosphoryliert und aktiviert den T-Lymphozyten
Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T cells)
Quelle:
C.R.Kissinger et al. (1995). Crystal structures of human
calcineurin and the human FKBP12-FK506-calcineurin
complex.. Nature, 378, 641-644.
1 Grundlagen
11
1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
Mycophenolat-Mofetil (MMF)
 Prodrug
 2-Morpholinoethylester der Mycophenolsäure (MPA)
 selektiver, nicht-kompetitiver und reversibler Hemmer der InosinmonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
 Greift in den Guanosinmonophosphat (GMP) – Stoffwechsel von B- und TLymphozyten ein
inaktive Prodrug (MMF)
aktiver immunsuppressiver Metabolit (MPA)
1 Grundlagen
12
1.4
GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen
Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie
2
Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
13
2.1
IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente
IMPDH-abhängige Oxidation
von IMP zu XMP
Angriffspunkt für
immunsuppressive MMFTherapie nach einer
Nierentransplantation
Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie
2
Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
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2.2


Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Methodenentwicklung zur quantitativen Analytik der katalytischen Restaktivität des Plasmaenzyms
Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) in peripherem Blut mittels RP-IP-HPLC nach
Hemmung mit dem Immunsuppressivum Mycophenolat
RP-IP-HPLC = reversed-phase ion-pairing high perfomance liquid chromatography
Quelle:chem.uft.uni-bremen.de
2
Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
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2.2
Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Prinzipielle Idee (keine Details! → Betriebsgeheimnis):
Isolation der
Lymphozyten-Fraktion
aus Patienten Vollblut
(Li-Heparin)
Zellaufschluss und
Enzymisolation
durch ein geeignetes
Inkubationsverfahren:
IMPDH-induzierter
Umsatz des Substrats
IMP zum Produkt XMP
Messung der Analyte
mittels RP-IP-HPLC
und Berechnung der
IMPDH-Restaktivität
3
Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
16


beim Menschen: zwei Gene welche für IMPDHs
codieren (IMPDH-1 u. IMPDH-2)
mehrere Isoformen von IMPDH-1 bekannt
→ alternatives Splicing der mRNA!
Quellen:
Prosise GL, Luecke H (February 2003), Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor and analogs: a
structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism
National Human Genome Research Institute
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Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
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Ziel:
Beitrag zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Förderung der Verständnisses
hinsichtlich IMPDH-Immundiagnostik

Korrelation der IMPDH-Genexpressionsaktivität und IMPDH-Enzymaktivität

Bezug zwischen Transkriptom und Proteom bei der IMPDH-Immundiagnostik

Inwiefern beeinflusst die MMF-Medikation die IMPDH-Genexpression und -regulation

…
Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
3
Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
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Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
Isolation des
Transkriptoms
(mRNA)
Generierung von
cDNA mittels RT
Amplifikation
von IMPDH-GenTranskripten
durch das Design
geeigneter Primer
Detektion und
Quantifizierung
von IMPDH-GenTranskripten
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