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Oxidation-induced intramolecular disulfide
bond inactivates mitogen-activated protein
kinase kinase 6 by inhibiting ATP binding
Yarui Diaoa, Wei Liua, Catherine C. L. Wongb, Xi Wanga, Kaman Leea, Po-yan Cheunga,
Lifeng Pana, Tao Xub, Jiahuai Hanc, John R. Yates IIIb, Mingjie Zhanga, and Zhenguo Wua,1
Reporter: Gao Wei
Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 7;107(49):20974-9.
邬振国
香港科技大学生命科学部教授
深圳北京大学香港科技大学医学中心教授
1,阐述了LMP1激活JNK及NF-KappaB信号通路的分子机理。
2,首次发现不同的JAK/STAT信号通路可以调控骨骼肌细胞的分
化 及因损伤诱导的骨骼肌再生。
3,阐述了MKK6的蛋白激酶活性受氧化还原状态调控的分子机理。
1. Diao Y, Guo X, Li Y, et al. Pax3/7BP is a Pax7-and Pax3-binding protein that regulates the
proliferation of muscle precursor cells by an epigenetic mechanism[J]. Cell stem cell, 2012, 11(2):
231-241.
2. Xiao, Fang, et al. "Oncostatin M inhibits myoblast differentiation and regulates muscle
regeneration." Cell research 21.2 (2011): 350-364.
3. Diao, Yarui, et al. "Oxidation-induced intramolecular disulfide bond inactivates mitogen-activated
protein kinase kinase 6 by inhibiting ATP binding." Proceedings of the National Academy of
Sciences 107.49 (2010): 20974-20979.
4. Ma, Ning‐Fang, et al. "Isolation and characterization of a novel oncogene, amplified in liver
cancer 1, within a commonly amplified region at 1q21 in hepatocellular carcinoma." Hepatology
47.2 (2008): 503-510.
5. Sun, Luguo, et al. "JAK1–STAT1–STAT3, a key pathway promoting proliferation and preventing
premature differentiation of myoblasts." The Journal of cell biology 179.1 (2007): 129-138.
“TXY” motif
ERKs:extracellular signalregulated kinases
JNKs:cJun N-terminal kinases
整体思路:
现象
1.验证MKK6是Redox sensor
2.验证MKK6形成分子内二硫键
机制
3.鉴定MKK6形成二硫键的关键Cys位点
4.验证MKK6二硫键影响酶活的相关机制
意义
5.验证hMKKs的redox调控具有普遍性
最初的问题,来源于对p38/MAPK信号通路受ROS调控的探究兴趣
上游的直接调控蛋白MKK6是否就是一个Redox sensor?
作者团队前期有研究MKK6:
Cheung, Po-yan, et al. "p150Glued, Dynein, and microtubules are specifically required for activation of MKK3/6
and p38 MAPKs." Journal of Biological Chemistry 279.44 (2004): 45308-45311.
验证MKK6是一个Redox sensor
(Trx)-6xHis-MKK6和(GST)-p38α(K82M) (kinase-dead)
TNF-α (10ng/mL):激活MAPK/p38 通路
PMA (1 μM): 佛波醇,促进内源性ROS
通过体内外实验,证实MKK6的活性受氧化还原调控,并且与二硫
键形成有关(DTT处理可以恢复活性)。
初步证实MKK6是一个受氧化还原调控的蛋白
接下来应该是思考如何进一步证实MKK6受氧化还原调控,并深入寻找调控机制。
寻找形成二硫键的Cysteine位点
验证氧化还原调控是通过作用于该位点来实现的
存在凝胶shift,同时非还原性胶,无多聚体(高
分子量条带):提示极有可能是分子内二硫键,
如何进一步确认?
β-mercaptoethanol:β-巯基乙醇,还原剂
C109是激酶活性改变的关键位点
体外验证:在结构分析假设的基础上,利用Cys突变,进行位点验证
猜测C109和C196形成二硫键
4C:C38S、C216S、C128L、C128M
DTNB巯基检测反应原理:
进一步验证C109与C196形成二硫键
先用IAM(碘乙酰胺:烷化剂,
与巯基结合)与巯基反应结合。
质谱shift: 57.02 Da
还原处理后,再用NEM(N乙
基-马来酰亚胺:烷化剂,与巯
基结合)与新生成的自由巯基
反应。质谱shift: 125.04 Da
进一步验证C109与C196形成二硫键
直接将重组的MKK6蛋白
进行酶解后质谱检测。
氧化形式的MKK6质谱检测
到含有二硫键结构肽段
还原形式的MKK6质谱未检
测到含有二硫键结构肽段
体内验证:C109和C196形成二硫键
A,
H2O2处理后,4C型MKK6不
存在还原形式巯基。
说明未突变的C109和C196是
二硫键形成位点。
B,先用IAA(碘乙酸)不可
逆与还原巯基结合,再还原
处理后用B-IAM标记新生成
还原巯基(即原来形成二硫
键的巯基)。
C,利用PMA(佛波醇)
处理RAW264.7细胞,诱导
内源ROS,会减少还原形
式的Bio-labled MKK6。
体内外验证了C109和C196是MKK6形成二硫键的Cys位点。
解释了MKK6受氧化还原调控的机制。
如何进一步说明MKK6的活性受氧化还原调控,是基于C109和C196的二硫键调控?
最开始的现象:
进一步的机制:
MKK6的C109和C196能形成二硫键,
并受Redox调控。
MKK6激酶活性受Redox调控。
?
MKK6的C109和C96与MKK6激酶活性之间的关系是什么?
验证质粒转染效果
C109和C196未突变型MKK6,激
酶活性收到H2O2影响,而6C型
MKK6,酶活不受H2O2影响
说明C109和C196可以影响MKK6活性:
胞内氧化可以引起C109和C196形成二
硫键,并降低MKK6的激酶活性
Sorbitol:山梨醇,可激活MAPK/p38信号通路
之前实验已经证实C109和C196可以影响MKK6活性:
胞内氧化可以引起C109和C196形成二硫键,并降低MKK6的激酶活性
二硫键的形成,是通过什么机制影响MKK6的激酶活性?
1,改变MKK6的空间结构,使酶结构域不能发挥作用?
2,改变MKK6底物结合域,不能作用于底物?
3,其他可能?
A,验证MKK6氧化型和还原型二级结构:二级结构没有发生改变
B,底物p38结合实验证实:氧化和还原状态对MKK6的底物结合能力影响不明显
C,检测MKK6与ATP的结合能力:氧化形式MKK6与ATP结合能力降低。
说明二硫键是通过影响MKK6的ATP结合能力,从而影响MKK6激酶活性。
圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法。
(BODIPY FL-AMPPNP:ATP类似物,作为荧光探针。
至此,已经证实:MKK6的C109和C196位点会在ROS
作用下,形成二硫键,从而阻断MKK6与ATP的结合,
导致MKK6失活,不再具备激酶活性。
这种调控是否具备普遍性?
其他MKK激酶是否也具备类似的调控?(位点、ATP结合能力)
“TXY” motif
ERKs:extracellular signalregulated kinases
JNKs:cJun N-terminal kinases
A,验证了C109和C196位点在hMKKs具备高度保守性
B,放射自显影:底物磷酸化检测,以JNKK和MKK1为例,验证了其他
hMKKs的激酶活性同样受Redox调控
总结:
验证了MKKs能够通过C109和C196位点的氧化,形成二硫键,从
而阻断与ATP的结合,导致失活,不再具备MAPKK激酶活性。
Thank you

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