Stáhnout

Report
Viry a mobilní DNA
Viry – kapitola 21
Mobilní DNA – kapitola 22
Viry
• Buněční parazité kompletně závislí na hostitelské buňce
• Neexistuje aparát pro translaci, replikaci a pro tvorbu ATP
• Virová částice (virion) obsahuje DNA nebo RNA a je obalena
proteinovým kabátem (kapsida)
• Being alive (virus) vs. living cells
•
•
•
•
•
DNA – genetická informace
RNA – poslíček
Ribozomy – translace
Proteiny – výroba ATP
Membrány – strukturní integrita
Morfologie viru
• Kapsida (kapsidový protein – je
kódován virem)
• NK
• Helikální vláknité viry
• 5-10nm v průměru
• Dlouhé až 1000nm
• NK vázáná ze vnitř
• Ikosaedrické viry
• Dvacetistěn
• Kapsida T1 - 60 molekul jednoho
proteinu (2-5kb)
• Kapsida T4 – 240 molekul (pojme
přes 10kb)
VIRION
Morfologie viru
• Komplexní struktura
• Kolem kapsidy ještě obal z napadené buňky (viry savčích buněk)
• Pučí z membrány, do které byl zabalen virový protein
• Bakteriofág
•
•
•
•
Ikosaedrická hlavička
Šroubovitý bičík
Vlákna
basální destička
Variabilita virového světa
• Infikují bakteriální, rostlinné a živočišné buňky
• Nejmenší virus má pouze 3 geny, nejkomplikovanější virus má 200300 genů
• Nejčastější velikost genomu je 8-20kb (6-15 genů)
• Mimiviruses
• Isoheadrický, 0,75uM
• 1,2Mbp genom, 900 genů
• Pandoraviruses
• Objeveny v roce 2013
• Genom 1.9 – 2.5 Mbp
• 2556 genů
Životní cyklus typického viru
• Přichycení se viru na hostitelskou buňku
• Vstup do buňky
• Pouze NK
• Celý nukleokapsid
• Replikace virového genomu
• Ranné geny
• Pozdní geny
• Výroba virových proteinů
• Sbalení virových částic
• Uvolnění virů do okolí (smrt hostitelské buňky)
Životní cyklus typického viru
• Ranné geny
• jejich promotory připomínají promotory
hostitelské buňky
• kódují proteiny důležité pro replikace
• Pozdní geny
• u některých virů jsou tyto geny přepisovány
virovou RNA polymerázou
• kódují proteiny kapsidy
Variabilita virového světa
• DNA viry
• Replikují se DNA polymerázou
• ssDNA
• dsDNA
• RNA viry
• Replikují se vlastní RNA dependentní RNA polymerázou, či reverzní
transkriptázou
• ssRNA
• Plusový (pozitivní) řetězec
• Záporný (negativní) řetězec
• dsRNA
• Lineární nebo cirkulární
• Replikace pomocí otáčivé kružnice
• u lineárních dojde k cirkularizaci DNA/RNA
Variabilita virového světa
RNA viry
• Výhody
• + RNA vlákno je ihned připraveno k translaci
• k replikaci doachází v cytoplasmě (vyhnou se jádru plného různých
enzymů na úpravu RNA)
• Nevýhody
• RNA polymerace pomocí RNA dependentní RNAP= RNA replikáza
• nevyskytuje se v buňce a tím pádem se nemohou spoléhat na
buněčný aparát
• Chybějí ssRNA vazebné proteiny, helikáze atd
• Syntéza minus vlákna, které musí být odstraněno při sbalování do
kapsidy
• Nemohou si dovolit příliš velké genomy – chyba RNAP je 1/10kb
• Maximální velikost genomu je 20kb
Replikační strategie RNA virů
•
•
•
•
Vlastní RNA dependentní RNA polymeráza
V cytoplasmě
Obvykle kódují 3-8 proteinů
Problémy:
• Některé geny je třeba přeložit častěji než jiné
• Polyproteinová strategie (autokatalytický sestřih vlastních proteinů) (picornaviry)
• Ignorace stop kodónů a start kodónů
• Subgenomová mRNA (alphaviry)
• Virová mRNA je „přitažlivější“ pro ribozom než vlastní mRNA
• Plus RNA musí mít čepičku již od bývalého hostitele
• Minus RNA – dojde k replikaci ( k segmentaci) a k přidání čepičky (virová RNAP –
2000AA, polyfunkční)
• Replikace virové RNA
• RNAP
• Fungují současně jako helikázy a SSB
RNA viry baktérií
• Nejmenší genomy vůbec
• Pouze 3 geny (4 proteiny)
• Kapsidový protein
• RNA replikáza
• Lytické proteiny (A1,A2), který lyzuje bakteriální stěnu
• Příklad:
• Bakteriofág Qβ, infikuje E. coli
• ssRNA (+), 4700bp
Pozitivní ss RNA viry
• Picornaviry
• Obrna, nachlazení, hepatitida A, kulhavka a slintavka
• 12 genů
• RNA (+) vlákno je využíváno k translaci (bezčepičková translace)
• Má 3‘ poly A konec
• 5‘ konec je chráněn proteinem Vpg nahrazující čepičku (nutný pro replikaci), pro
translaci je důležitá sekvence 150 – 600bp poté
• Viry kódují proteázu štěpící CBP faktor-vyřadí tím všechny buněčné mRNA
• Je vytvářen polyprotein, který je následně naštípán na 10 – 20 proteinů
• Repilkační cyklus alphaviru - ss (+) RNA virus
•
•
•
Průnik do buňky endocytózou
Virový genom je vpuštěn do cytoplasmy
1 nestrukturální polyprotein (nsPs) je přepsán
• nsP1 – syntéza negativního vlákna
• nsP2 – RNA helikáza, proteináza – zastavuje
transkripci hostitele
• nsP3 – replikáza
• nsP4 – RNAP
•
•
Syntéza celého minus vlákna
• templát pro syntézu
subgenomické RNA
polyprotein C-pE2-6K-E1
• templát pro syntézu
• genomické RNA
Sbalení virové částice a vypučení ven
Biology and pathogenesis of chikungunya virus
Olivier Schwartz & Matthew L. Albert
Negativní ss RNA viry
• Evolučně velmi mladá skupina virů
• Velmi virulentní
• Vzteklina, spalničky, příušnice, chřipka, Ebola etc.
• Vnější membrána je odvozena od membrány hostitelské buňky
• Musí si přinést svou RNP komplexy
• Genomová RNA má na svých koncích vždy invertované
repetice 15 -20bp dlouhé
• N-P-M-G-L geny (na + řetězci)
• Protein N
• povrch kapsidy
• Anti-terminační účinky
• Až 100x více než proteinu G
Messenger RNA Cap Methylation in Vesicular Stomatitis Virus, a Prototype of
Non‐Segmented Negative‐Sense RNA Virus
Jianrong Li1, 2, 3 and Yu Zhang1
dsRNA viry
• dsRNA viry
•
•
•
•
Poměrně vzácné
Asi 12 kusů dsRNA, každý kóduje jeden protein
Rotaviry
Replikační komplexy jsou uvnitř kapsidy
DNA viry
• Replikují se v jádře buňce a využívají běžných buněčných
mechanismů pro replikaci a transkripci
• Musí se vyrovnat se striktní kontrolou buněčného cyklu
• Virus bývá schopen produktivní infekce jen za nepříznivých
okolností a v omezeném spektru tkání
• Většinou je infekce latentní
Transformace buněk – oslabení kontroly buněčného cyklu směřující
k neomezenému množení
Začlenění DNA viru do genomické DNA
dsDNA viry
• dsDNA viry baktérií
• typický baktériofág
• T4, lambda, P1, Mu
• dsDNA viry vyšších organismů
• Papaoviry (polyoma a papiloma)
• Nejmenší dsDNA viry (5kb)
• T-antigen
• Protein ovlivňující buněčný cyklus (vyvazuje p53 protein, vstup do S fáze)
• Při dostatečném množství iniciuje replikace virového genomu
• Latentní infekce vedou ke vzniku nádorů
• Herpesvirus
•
•
•
•
Opar, sexuálně přenosný herpes, plané neštovice, mononukleózu
Největší jaderné DNA viry (150 – 230kb)
Obrovský arsenál vlastních proteinů
Latentní herpesviry
DNA viry
• dsDNA viry vyšších organismů
• Poxvirus
• Velmi komplexní (150 – 200 genů)
• viditelné pod světelným mikroskopem (0,4 -0,2 uM)
• K replikace dochází v cytoplasmě buňky (jako jediný DNA virus)
• V kapsidě má svou RNAP, 2-3 transkripční faktory, 3 enzymy pro syntézu a
metylaci čepičky, DNA topoisomerazu, DNAP
• dsDNA viry rostlin
• Poměrně vzácné
• CMV virus – cauliflower mosaic virus
Bakteriální virus - bakteriofág
• Objeveny v roce 1917
• Phage – řecké slovo pro „ jíst“
• Využívány hojně v molekulární biologii
• Bakteriofág  - nejvíce studovaný
organismus
• Pouze DNA/RNA vstupuje do buňky
• 1952 – pokus s bakteriofágem ukazující, že
DNA je nositelem genetické informace
• Fágové – nejpočetnější skupina živé formy
•
•
•
•
1030 baktérií, každá má 10 fágů
1031 fágů
Mořská voda – 50x106 virů na 1 ml
Ničí 40% baktérií denně – koloběh uhlíku
Životní cyklus bakteriofága
• Navázání se na buňku
• Vstup do buňky
• Vstupuje pouze DNA/RNA
•
•
•
•
Replikace virového genomu
Výroba virových proteinů
Sbalení nových virových částic
Uvolnění z buňky
Expresní strategie dsDNA fágů
• 95% všech fágů je ds DNA
• Proces infekce:
• Časná fáze
• Slabá transkripce časných genů bakteriální RNAP
• Transkripční geny
• Geny interferující s restričkním systémem baktérií
• Proteiny zabraňující superinfekci
• Střední fáze
• Transkripce hlavních fágových replikačních proteinů
• Pozdní fáze
• Intesivní replikace fágové DNA
• Silná exprese kapsidových proteinů
Lytický vs latentní cyklus
LYSIS
LYSOGENIC
cro je ON/
cI je OFF
cro je OFF/
cI je ON
Exprese fágových genů je ON
Exprese fágových genů je OFF
20-40 minut
10 – 100 fágů
Plak 4-10mm
Virus integrovaný do genomu – provirus,
prophage
Integrace do genomu může být přes
definovaná místa ( attachment site), nebo
náhodná
Louis Pasteur ( 1822 – 1895)
 Zakladatel moderni lékařské
mikrobiologie
 pasterizace/sterilizace
 podpora teorie, že za nemocí stojí
choroboplodné zárodky
 První vakcinace za použití
laboratorně oslabeného organismu
(viru, či bakterie)
 Vakcína proti anthrax a vzteklině
Eradikace neštovice









Edward Jenner (1749 – 1823)
Virus Variola major, V. minor
Vaccinace=vacca=kráva
20. století – 300-500 milion lidí
umírá
26.10. 1977 – poslední případ
9.12. 1979 - eradikace
1986 – konec očkování
2 vzorky stále na světě (CDC,
Atlanta a State Research Center for
Virogology, Koltsovo, Russia)
Nebezpečí použití jako biologické
zbraně
Vítězství nad obrnou








Jonas Salk (1914 – 1955)
virolog
Vakcína proti dětské obrně
Obrna patřila mezi nejobávanější
nemoci poválečných let
1952 – 58 000 případů obrny
1954 – klinické testy, nejrozsáhlejší
vůbec (1 800 000 dětí se účastnilo
testů)
12.4.1955 - vakcína funguje
1962 – orální vakcína (Albert Sabin)
Mobilní elementy - transpozony
• Mobilní DNA – dochází k přesunu DNA v rámci jádra (přesun
na různé chromozómy
• Skákající geny, mobilní elementy, kontrolující elementy atd.
• proces je nazýván transpozice
• Transpozony nejsou nikdy samostatně
• Transpozony
• DNA
• RNA - Retroposony
• Způsoby transpozice
• Konzervativní (cut and paste)
• Replikativní (copy and paste)
DNA transpozon
• Inverzní repetice na svých koncích
• 9-40 bází
• ORF 1kb – transponáza
• Frekvence transpozice je 1/1000 až 1/10000 na 1 transpozon
na buňku
• Cílová sekvence – rozpoznávána transponázou
• 3-9bp
• Transponózy nesou geny pro resistenci na antibiotika,
virulentní geny, metabolické geny
750 nt – 15,000 nt
Cut and paste transpozice
• Konzervativní (nereplikativní)
Cut and copy transpozice
• Replikativní (nekonzervativní)
• Více komplexní transpozice
• Resolváza rozeznáva interní místo (cílovou sekvenci)
• Částečně palindromická sekvence 30-40bp
• Dochází k replikaci transponózu
Cut and copy transpozice
transponáza
transponáza
resolváza
Bakteriální transpozony
• 1. transpozóny, u nichž byla definována
molekulární podstata
• Nejjednodušší transpozóny
• Inserční sekvence – IS
• IS1, IS2 atd.
• 750 – 1500 bp dlouhé, repetitivní konce
jsou 10 – 40bp
• Pouze cut-paste transpozice
• Transponóza je exprimována pouze,
když dojde k posunu o jednu bázi – ne
moc běžné
• Jinak exprese regulačního proteinu A –
transkripční reulátor
• Neregulovaná transpozice by vedla ke
zničení chromozómu
Regulace transpozice Tn10
•
•
•
•
Bakteriální transpozón
Kompozitní transpozón nesoucí gen pro resistenci na tetracyklin
Transpozice nereplikativním způsobem
Transpozice je silně regulována
• Antisense RNA (transript z Pout se překrývá s Pin)
• Mutace transponázy v IS1 OL
• Transpozice je inhibován dam methylací (GATC sekvence promotoru
transponázy, k transpozici docházi v pouze momentě replikace, kdy
DNA není methylována)
Transponáza zmutovaná
1-10% aktivity
Transponáza plně funkční
Bakteriofág Mu
• Virus vs transpozón
• Genom 38kb
• Po infekci se integruje do genomu pomocí nereplikativní
transpozice
• Promotory replikačních genů jsou zareprimovány
represorem
• Fág je stabilní a nepřesouvá se
• Vhodný podnět (SOS reakce) – ranný promotor se
odblokuje, nastane silná replikativní transpozice, přemístí
si až 100x
• Odblokuje se i pozdní promotor – syntéza kapsidových
proteinů
Transposony vyšších organismů
• Barbara McClintock (Nobelova cena v roc 1983)
• Experimenty s kukuřicí (maize)
• Ac/Ds rodina transpozonů
• Ac – aktivátor
• Ds - disociátor
•
•
•
•
Repetitivní konce 11 bazí
Cílová sekvence – 8bp
Ac element je 4500bp, plně funkční
Ds element je defektni Ac element
Další typy DNA transpozónů
• P elements – Drosophilla
melanogaster
• Objeveny Margaret Kidwell při
studui hybdridní dysgeneze
• M kmen – v laboratoři od 1905
• P kmen – v přírodě
• Křížením M kmene (samice) a P kmene
(samce) – sterilní potmostvo
• V M kmenech v somatických buňkách
se translatuje represor
• P elementy jsou využívány v
genetice
• Vypínání genů
• Taggovaní genů
• Příprava mutantů
Další typy DNA transpozónů
• Tc1/Mariner like transpons – všude, nejběžbější typ
transpozónu
• Sleeping beauty transpozon (usnul před 10-15 milióny let)
• Transpozóny obratlovců jsou většinou zmutované a nefunkční
• Zrekonruován původní transpozón – velmi aktivní
• „virulence“ transpozónů klesá v průběhu evoluce
RNA transpozóny - retroposony
• Původní RNA transkripty, která se reverzní transkripcí změnily
na DNA a integrovaly se zpět do chromozómů
• Po transkripci své DNA jsou schopni transpozice – kódují si
vlastní reverzní transkriptázu (RT)
• Retroposon je transpozon, který je mobilizovaný ve formě RNA,
která musí být přepsána do cDNA
• Transponová RNA je v jádře volná a tudíž umožňuje transpozici
do vzdálených míst
•
•
•
•
Musí kódovat transponázu
Musí kódovat RT
Případně proteiny chránící před všudepřítomnými Rnázami
Proteiny, které umí zabalit RNA a chránit ji
• Virová (LTR) nadrodina
• LTR – long terminal repeats
• Nevirová (non LTR) nadrodina
• U rostlin a živočichů představují až 50% genomu
LTR retroposony
• Objeveny Geery Finkem v 80. letech
• Kvasinkový systém, mutace v His4 genu
(1500 různých, dvě revertují)
• Ty elementy kvasinky
• Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 a Ty5
• Jejich transkripty představují as 5% veškeré
mRNA v buňce
• ~6.3 kb, 330 dlouhé LTR
• Frekvence transpozice 10-7 az 10-8
• Velmi podobné retrovirům, jen nemají
(ztratili, nebo ještě nezískali) ORF pro env
• Copia elementy D. melanogaster
• ~5000bp, 276 dlouhé LTR
• 20 – 60 kopií na buňku
• Frekvence transpozice 10-3 az 10-4
LTR retroposony
LTR retroposony
Retroviry
• Vir obsahuje ssRNA (pozitivní)
• Především u ptáků a savců
• V hostitelské buňce může být integrován do
DNA
• Reverzní transkriptáza
• Nejpůvodnější a nejprimitivbější
• Je velmi pomalá a chybující, bez korektury
• Templát je okamžitě degradován (Rnase H aktivita)
• Některé retroviry jsou původci rakovinných
změn v lidském těle
Replikační cyklus retroviru
Nikdy nedochází k translace retrovirové RNA
Virus si přináší
reverzní transkriptázu
Integrázu
tRNA
Reverzní transkriptáza
integráza
Genom retroviru
• Gag – kapsidové
proteiny
• Matrixový
• Kapsidový
• Nukleokapsidový –
váže virovou RNA
• Pol – enzymy
• Proteáza
• Reverzní
transkriptáza
• integráza
• Env – obalové
proteiny
• povrchový protein
• Transmembránový
protein
Unikátní U5 sekvence + PBS sekvence
Silný promotor v U3 oblasti
Pouze jeden – retrovirus kombinuje strategii subgenomových mRNA s polyproteinovou
Non LTR retroposony
• Nevirové
• Sestřihové pseudogeny
• Úseký, odpovídající cDNA kopii transkriptu RNA (někeré mají dokonce poly A/T)
• Nejsou funkční
• nejsou hojné (pouze 0,5% genomu člověka)
• LINES – long interspersed nuclear sequences
• SINES – short interspersed nuclear sequences
LINES
•
•
•
•
Genomové cDNA kopie transkriptů RNAP II a III
Jsou velmi hojné, velmi příbuzné
K transpozici L1 dojde u 10 z 250 lidí (pouze v zárodečné linii)
2 ORF
• RNA vazebný protein
• RT s nukleázou
SINES
•
•
•
•
•
Nejznámější tzv. Alu sekvence (200bp)
cDNA kopie transkriptů RNAP III (připomínají sekvence 7SL RNA)
Až milióny kopií v genomu
10% genomu
Tvoří významnou část repetitivní DNA
jsou náhodně roztroušené
Význam transpozónů v lidském
genomu
C-paradox
• Chybí korelace mezi velikostí genomu a biologickou komplexností
ssDNA viry baktérií
• Bakteriofág X174
• 5386 bp, 11 genů
• 5 genů se překrývá
• Gen D a gen E
• Gen D důležitý pro sbalení kapsidy
• Gen E rozrušuje bakteriální stěnu a umožňuje uvolnění viru z buňky
• Bakteriofág M13
• Dlouhé filamentum
• Infikuje pouze F baktérie
• M13 virus nezabíjí baktérie, používá se na přípravu ssDNA
Replikace retrovirů
RNA
DNA
Strong stop minus DNA
PBS sekvence
Spárování
Dlouhý usek
pyrimidinů, který
není schopna RT
rozštípat

similar documents