osocze/surowica

Report
BIAŁKA W DIAGNOSTYCE
LABORATORYJNEJ
Karolina Słapek
Gr. A/B
III OAM
Białka
związki zbudowane z aminokwasów
(min. 100) połączonych wiązaniem
peptydowym -CONH-
FUNKCJE BIAŁEK







katalityczna – enzymy
strukturalna – np. kolagen, elastyna, keratyna
ochronna – immunoglobuliny
skurcz – aktyna, miozyna
transport – albumina (kw. tłuszczowe),
hemoglobina (tlen), transferyna (żelazo)
regulacja hormonalna – insulina
regulacja genowa - histony
BIAŁKA W DIAGNOSTYCE
LABORATORYJNEJ
•
•
•
OSOCZE/SUROWICA
MOCZ
PMR
OSOCZE/SUROWICA
Rola białek osocza:
 dystrybucja płynów krew/przestrzeń
pozakomórkowa
 hemostaza i koagulacja
 funkcje transportowe (nośniki hormonów,
metabolitów, metali, leków)
 enzymy, regulatory
 białka ukł. odpornościowego
 składniki ukł. buforowego
 hormony i receptory
 składniki ukł. tkanki łącznej
 materiał odżywczy
OSOCZE/SUROWICA
Powstawanie białek:
 albumina – wątroba
 immunoglobuliny – limfocyty
 hormony, enzymy, apoproteiny – różne narządy
Utrata białek:
 katabolizowane w wątrobie
 albuminy – rozkład w skórze
 trawienie w przewodzie pokarmowym (5g/dobę)
 filtracja nerkowa (20-80mg białka, w tym nie
więcej niż 30mg albuminy; większość
resorbowana)
OSOCZE/SUROWICA
Stężenie białka całkowitego w osoczu w
warunkach prawidłowych wynosi
66-87g/l (w surowicy – brak
fibrynogenu – wynosi 65-82g/l).
OSOCZE/SUROWICA
Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy
głównie od równowagi między syntezą i
degradacją dwóch głównych frakcji
białkowych: albumin i immunoglobulin. Inne
frakcje białka nie wpływają znacząco na
poziom białka całkowitego.
OSOCZE/SUROWICA
Hipoproteinemie:
 obniżenie poziomu białek w wyniku utraty białek,
zahamowania ich syntezy lub rozcieńczenia krwi
 główną przyczyną jest zmniejszenie stężenia
albuminy w łożysku naczyniowym (rzadko
niedobór immunoglobulin)
 obniżenie wartości stosunku albumina/globulina
obserwujemy w:
•
•
•
•
marskości wątroby
zespole nerczycowym
niektórych chorobach infekcyjnych
szpiczaku mnogim
OSOCZE/SUROWICA
Hiperproteinemie:
 powstają w wyniku zwiększonej produkcji
jednej lub wielu klas Ig
 zwiększeniu stężenia immunoglobulin
często towarzyszy obniżenie poziomu
albuminy
 hiperproteinemia z hiperalbuminemią
mogą być wywołane odwodnieniem lub
artefaktem (zbyt długo zaciśnięta staza)
OSOCZE/SUROWICA
Przyczyny hiperproteinemi:
 —
hipergammaglobulinemie monoklonalne
• szpiczak mnogi,
• makroglobulinemia Waldenströma,
• nowotwory układu chłonnego,

hipergammaglobulinemie poliklonalne
• przewlekłe stany zapalne,
• choroby autoimmunologiczne,

przewlekłe choroby wątroby
• marskość,
• wirusowe zapalenia,

błędy w pobieraniu krwi
OSOCZE/SUROWICA
Odczyn Biernackiego a białka osocza?
Szybkość OB jest wypadkową składu
osocza oraz właściwości erytrocytów.
Zwiększenie stężenia fibrynogenu, białek
ostrej fazy oraz spadek stężenia albuminy
powodują wzrost OB.
OSOCZE/SUROWICA
Prawidłowy skład frakcji białkowych surowicy w
rozdziale elektroforetycznym
FRAKCJA
%
BIAŁKA
albuminy
55.0 – 70.0
α1
1.1 – 4.2
α1-antytrypsyna, α1-kw. glikoproteina,
α-lipoproteina
α2
4.4 – 13.0
α2-makroglobulina, haptoglobina
β
7.3 – 13.5
transferyna, β-lipoproteina, frakcja C3
dopełniacza
γ
8.1 – 19.9
Immunoglobuliny, białko C-reaktywne
albumina
OSOCZE/SUROWICA
Elektroforeza białek surowicy
Polega na rozdziale białek surowicy w polu
elektrycznym na różnego rodzaju
podłożach w buforze o zasadowym pH. W
tych warunkach większość białek jest
anionami i wędruje w kierunku anody
(zwłaszcza białka mniejsze – albuminy i αglobuliny).
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
Albumina:
 prawidłowa zawartość – 40-52g/l
 synteza w wątrobie, rozkład w skórze
 bisalbuminemia
 analbuminemia
 niespecyficzny system transportowy
(hormony, witaminy, Ca, Mg, kw. tłuszczowe,
leki, bilirubina, lipidy)
OSOCZE/SUROWICA
Białka ostrej fazy:
 grupa białek syntetyzowanych w wątrobie, których
poziom wzrasta w przebiegu stanów zapalnych,
chorób zakaźnych, urazów, nowotworów oraz
procesów martwiczych
 czynniki aktywujące syntezę białek: produkty rozpadu
uszkodzonych tkanek, cytokiny
 zaliczamy:
•
•
•
•
•
•
α1-antytrypsynę (AAT)
α1-kwaśną glikoproteinę (AAG)
haptoglobinę
ceruloplazminę (CER)
fibrynogen
białko C-reaktywne
OSOCZE/SUROWICA
Ujemne białka ostrej fazy:
—
Albumina
—
Transferryna
—
Prealbumina
Dodatnie białka ostrej fazy:








—
fibrynogen
—
α1- antytrypsyna (AAT)
—
ceruloplazmina
—
haptoglobina (HP)
—
białko C-reaktywne (CRP)
—
surowicze amyloidowe białko A (SAA)
—
laktoferryna
—
białka układu dopełniacza
OSOCZE/SUROWICA

α1-antytrypsyna – inhibitor proteaz; inhibicja elastazy uwalnianej podczas
fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste;

α1-glikoproteina – odpowiada za wiązanie i transport progesteronu; wzrost w
stanach zapalnych, spadek w ciężkich uszkodzeniach wątroby;

haptoglobina – odpowiada za wiązanie i transport Hb pozakrwinkowej;

ceruloplazmina – katalizuje utlenianie Fe2+ do Fe3+

fibrynogen – ważne białko układu krzepnięcia

białko C-reaktywne – jego poziom wzrasta w zakażeniach bakteryjnych,
rozległych urazach, chorobach nowotworowych, oparzeniach oraz martwicach
narządowych;

α2-makroblobulina – drugi po AAT inhibitor proteaz takich jak trypsyna,
chymotrypsyna, trombina, plazmina i kalikreina;

transferyna – transportuje jony Fe3+ do szpiku kostnego;

białka układu dopełniacza – zespół ok. 20 różnych białek; jego działanie polega
na aktywacji kaskady enzymatycznej, doprowadzającej do szeregu zjawisk
mających istotne znaczenie w przebiegu odpowiedzi immunologicznej i reakcji
zapalnej.
OSOCZE/SUROWICA
Immunoglobuliny:
 syntetyzowane przez limfocyty B
 mają zdolność do swoistego rozpoznawania
antygenu
OSOCZE/SUROWICA
IgG – główne przeciwciała wtórnej odpowiedzi centralnego
systemu odpornościowego
 IgD – mało poznane przeciwciała receptorowe występujące
na powierzchni limfocytów B
 IgE – wysoko cytofilne przeciwciała alergicznej odpowiedzi
typu 1 (alergia anafilaktyczna); występują w krążeniu w
niewielkiej ilości, opłaszczone są gł. na bazofilach i
mastocytach
 IgA – występują w 2 podklasach:

• IgA1 – niewielka grupa przeciwciał monomerycznych występujących
w krążeniu
• IgA2 – przeciwciała dimeryczne; uczestniczą w we wtórnej
odpowiedzi śluzówkowej systemu MALT

IgM – główne przeciwciała pierwotnej fazy odpowiedzi
humoralnej; są pentamerami (rzadziej heksamerami)
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
Hipogammaglobulinemie:
 nabyte:
nowotwory układu chłonnego
po usunięciu śledziony
jelitowe i nerkowe zespoły utraty białka
leczenie cytostatykami lub promieniowaniem
jonizującym
• niedokrwistość złośliwa, hemoglobinopatie
• zaburzenia dojrzewania immunoglobulin u
dzieci
•
•
•
•
OSOCZE/SUROWICA

Wrodzone
• izolowane niedobory IgA lub IgM
• agammaglobulinemia związana z płcią (chłopcy
– wszystkie Ig ↓↓)
• kombinowany zespół niedoboru
immunologicznego (IgG ↓, limfopenia,
deaminaza adenozyny ↓)
• niedobór przeciwciał z niezbornością
naczyniakową
• niedobór immunologiczny z trombocytopenią
OSOCZE/SUROWICA
Hipergammaglobulinemia:
 reakcja organizmu na różnego typu zakażenia
 odpowiedź poliklonalna – Ag mikroorganizmów
powodują stymulację licznych linii limfocytarnych
•
•
•
•

ostre stany zapalne
ostre WZW
marskość wątroby
AIDS
odpowiedź monoklonalna – w wyniku chorób
nowotworowych ukł. chłonnego dochodzi do
rozrostu pojedynczych linii limfocytów B
• przewlekłe białaczki limfatyczne
• szpiczaki
• chłoniaki
MOCZ
W warunkach fizjologicznych nerki wydalają
niewielką ilość białka – do 150mg/24h.
Podwyższona ilość białka pojawia się
najczęściej w chorobach nerek przy
zwiększonej przepuszczalności kłębuszków
nerkowych.
Mikroalbuminuria to zwiększone wydalanie
albumin (powyżej 30mg/24h) przy nie
ujawniającym się białku w moczu. Służy do
wczesnego wykrywania nefropatii.
MOCZ
Rodzaje białkomoczu
Rodzaj białkomoczu
Ilość białka
prawidłowy
<150mg/24h
znikomy
<500mg/24h
mierny
0.5 – 3.5g/24h
masywny
>3.5g/24h
MOCZ
Rodzaje białkomoczu:
1.
przednerkowy



gammapatie monoklonalne
zespoły hemolityczne
mioglobinemie
kłębkowy
2.



kłębkowe zapalenie nerek (dzieci)
nadciśnienie
gammapatie monoklonalne
kanalikowy
3.


przeszczepy nerek
choroby układowe
pozanerkowy
4.



zapalenie dróg moczowych
nowotwory
uszkodzenia mechaniczne
PMR
Białko całkowite w PMR wynosi 0,15 –
0,45g/l, z czego 80% pochodzi z surowicy a
20% powstaje lokalnie w przestrzeni
wewnątrzczaszkowej.
PMR
Badanie elektroforetyczne PMR ma duże
znaczenie w diagnostyce stanów
zapalnych mózgu oraz przy zaburzeniach
przepuszczalności ścian splotu
naczyniowego.
Przed rozdziałem elektroforetycznym
PMR musi być 100-200-krotnie
zagęszczony!
PMR
Prawidłowy obraz elektroforetyczny PMR:
- obecne wszystkie frakcje występujące w
surowicy
- duża zawartość β-globulin
- zmniejszona zawartość γ-globulin
- frakcja V-prealbuminy oraz frakcja τ
znajdują się między β i γ-globulinami
- brak fibrynogenu
PMR
Głównym celem badań poziomu białka
całkowitego i białek specyficznych jest
ocena przepuszczalności bariery krewPMR oraz wykrywanie wewnątrzpłynowej
syntezy immunoglobulin.
PMR
I = albumina PMR(mg/dl)/albumina surowica(g/dl) ~<9
I<9 – prawidłowa bariera krew-PMR
I=9-14 – lekkie upośledzenie
I=14-30 – umiarkowane upośledzenie
I=30-100 – poważne upośledzenie
I>100 – całkowite załamanie bariery
PMR
I=IgG PMR/albumina PMR ~<0.27
Wartość współczynnika wyższa niż 0.27
wskazuje na wewnątrzpłynową syntezę
IgG.
PMR
Wskaźnik Linka i Tiblinga
I= [IgG PMR/IgGsur]/[Alb PMR/Albsur] ~<0.7
IgG PMR – stężenie IgG w PMR
IgGsur - stężenie IgG w surowicy
Alb PMR – stężenie albuminy w PMR
Albsur– stężenie albuminy w surowicy
Wartości wyższe niż 0,7 świadczą o syntezie IgG w PMR.
METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Metoda biuretowa
 Metoda Lowry’ego (Folin-Ciocalteu)
 Metoda z użyciem kwasu biscynchoninowego
 Metoda Bradforda
 Absorbancja w nadfiolecie
 Metoda nefelometryczna
 Metoda turbidymetryczna

METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Metoda biuretowa
Odczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy, NaOH, KI
Pomiar absorbancji: 540nm
Zakres liniowości metody: 2-15g/l
Zasada metody: reakcja jonów Cu2+ z wiązaniem peptydowym
Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w surowicy
METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Metoda Lowry’ego
Odczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy, NaOH,
Na2CO3, odczynnik Folin-Ciocalteu
Pomiar absorbancji: 750nm
Zakres liniowości metody: 10mg/l-1g/l
Zasada metody: 1) reakcja aminokwasów z odczynnikiem
Folina
2) reakcja biuretowa
Materiał: mocz, PMR
METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego
(BCA)
Odczynniki: Na2CO3, NaOH, winian sodowy, CuSO4,
BCA
Pomiar absorbancji: 562nm
Zakres liniowości metody: 0.1-1g/l (mikrometoda) lub
0.5-10mg/l (makrometoda)
Zasada metody: w alkalicznym środowisku niektóre
składniki białek (tyrozyna, tryptofan,
cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do
Cu1+ (które tworzą barwny kompleks z BCA)
METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Metoda Bradforda
Odczynniki: Coommassie Brillant Blue G-250 (CBB
G250), 95% etanol, 85% kwas fosforowy
Pomiar absorbancji: 595nm
Zakres liniowości metody: 1-10μg (mikrometoda) lub
10-100μg (makrometoda)
Zasada metody: w metodzie wykorzystuje się zdolność
wiązania barwnika błękitu brylantowego
- CBB G250 z grupami aminowymi białek.
METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Absorbancja w nadfiolecie
Pomiar absorbancji roztworu białka przy dł. fali
280nm
Metoda używana do oszacowania stężenia
białka.
METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Metoda nefelometryczna
Polega na pomiarze natężenia światła rozproszonego
pod kątem różnym od 180 stopni w stosunku do kąta
padania światła.
Nie nadaje się do oznaczeń w roztworach wstępnie
mętnych.
METODY OZNACZANIA
BIAŁEK
Metoda turbidymetryczna
Odczynniki: kwas trichlorooctowy (TCA), kwas
sulfosalicylowy, chlorek benzetonium, NaOH
Zakres liniowości metody: 2-200mg/dl
Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w moczu i PMR
Dziękuję za uwagę

similar documents